人工microRNA(amiRNA)技術使研究人員能夠使用少至21個核苷酸(nt)來指導特定轉錄物的有效沉默。然而，并非所有人工設計的amiRNA建構體都會選擇預期的~21nt引導鍊amiRNA。從成熟的miRNA雙鍊體中選擇miRNA引導鍊已在人類和昆蟲系統中進行了詳細研究，但對植物的研究卻不多。在這裡，作者比較了DNA病毒載體（番茄斑駁病毒，基于ToMoV）、RNA病毒載體(煙草花葉病毒，基于TMV)和非病毒二進制載體在植物中表達amiRNA。然後，我們使用深度測序和突變分析表明，當排除成熟amiRNA雙鍊體中堿基錯配引起的結構因素時，成熟amiRNA區域的核苷酸組成決定了引導鍊的選擇。我們發現具有過量嘌呤的鍊被優先選擇作為引導鍊,并且在amiRNA雙鍊體中沒有錯配的人工miRNA主要加載到AGO2中，而不是像大多數植物内源miRNA一樣加載到AGO1中。通過對目标效應進行分析，我們還表明，隻有當目标鍊被選為引導鍊并顯示AGO負載時,amiRNA才能提供預期的RNAi效應。是以，通過去除成熟amiRNA雙鍊體中的錯配并設計預期的引導鍊以包含過量的嘌呤,可以更好地控制amiRNA的引導鍊選擇以實作功能性RNAi效應。
人工microRNA(amiRNA)被用于調節植物和動物對病毒的抵抗作用，作為疾病的潛在生物标志物。miRNA由内源性非編碼RNA加工而成是基因表達的重要調節因子。在植物中，初級miRNAs（pri-miRNAs）表現出特定的二級結構，首先被加工成前體miRNAs（pre-miRNAs），然後通過DCL1進入細胞核中形成miRNA雙鍊體，将miRNA雙鍊體重新定位到細胞質中。随後，miRNA雙鍊體加載到RISC複合物中的AGO蛋白中，并選擇其中一條鍊作為引導鍊。當miRNA結合RISC遇到目标RNA時，後者就會被降解或翻譯抑制。在植物和動物中miR/miR*（引導鍊/随從鍊）雙鍊體相似，長度約為20-24nt，兩條鍊之間不完全互補，且具有2nt的3’端懸垂。
在植物應用的amiRNA技術提供了替代和改進現有基因沉默方法，并使用内源性pri-miRNA主鍊，但将miRNA和miRNA*替換為人工設計的目标轉錄物的amiRNA/amiRNA*序列。
圖一：pri-miR319a和部分pri-amiRNAs的預測折疊結構。
(a)5p和3p臂miRNA雙鍊體的。成熟的miR319a雙鍊區包含3個錯配在5p和3p鍊之間。(b)引導鍊amiRA2和amiRA2c，從amiRA2中删除了5p和3p鍊之間的不比對序列結構。
圖二：miR319a骨架主鍊剪切生成amiRNA并克隆到三個不同的載體中。兩種病毒載體TRBO和TAV在二進制載體pCB301載體中，非病毒載體是二進制載體pGWB2。TRBO和pGWB2均由花椰菜花葉病毒的35S啟動子驅動。
圖三：建構TAV-amiRNA-EGFP_target載體和TAV-EGFP_target（空載體）結構的序列組織。雙元載體pCB301可以用于所有TAV病毒載體克隆。TAV-amiRNA或具有OCS終止子序列和同時含有35S啟動子序列驅動的EGFP被克隆到二進制載體的T-DNA右邊界(RB)和左邊界(LB)序列CR之間。病毒共同區域（CR）以藍色框表示。病毒基因：AC1（Rep；複制相關蛋白）、AC2（TrAP；轉錄激活蛋白）、AC3（REn；複制增強子）和AC4用淺藍色表示。pri-miR319a骨架的上遊和下遊序列用灰色表示。amiRNA-靶序列被克隆在EGFP序列的3'端UTR區域。
将建構好載體轉化到根癌農杆菌中并注射到本氏煙草植物葉子中，分别進行Northern印迹雜交和PCR分析确認重組TRBO和TAV病毒載體的複制。
原文連結：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.13786
植物科學最前沿，專注于植物科學前沿進展、資訊、招聘資訊的釋出及方法軟體共享等。投稿及招聘請背景回複“投稿”，均為無償；商務合作請聯系微信ID：zwkxqy；