CRISPR/Cas9技术是一种屡获殊荣的基因编辑工具。由于其高效率和精准的基因组修饰，它可以在生命科学领域实现肿瘤、遗传病和传染病等重大疾病的治疗。然而，缺乏合适的递送系统也限制了CRISPR/Cas9技术的临床应用，因此该领域的研究也值得关注。
在《学术在线》第12期中，我们邀请了浙江大学教授、博士生导师袁平教授与我们分享基因编辑非病毒载体在疾病治疗中的应用。
基因编辑技术
基因编辑可精确地破坏、插入或替换基因组中特定位点的DNA序列，在基因功能的研究和遗传病的治疗中起着重要作用。由工程内切酶（EEN）介导的基因编辑技术大大改善了基于同源重组的早期基因靶向技术的低效率，使研究人员能够有效地编辑各种细胞类型和生物体的任何基因。
图|基因编辑过程中的三个步骤
目前，有巨核酸酶、锌指核酸酶（ZFN）、转录激活因子样效应核酸酶（序列化激活剂样效应核酸酶N）、簇有规律间隔短回重复序列（CRISPR）等四种工具酶及其相关蛋白，是基因编辑技术中应用最多的。
无论是ZFN，TALEN还是CRISPR / Cas9，它们都由DNA鉴定结构域和核酸皮内酶组成，它们在结构上是相似的。ZFN技术具有识别靶DNA的锌指结构域，而TALEN的DNA鉴定区域是典型系列TALE重复序列的中心结构域，DNA剪切区域是称为Fokl的核酸内酶结构域。CrispR的DNA鉴定区域是crRNA或向导RNA，Cas9蛋白负责DNA的剪切。当DNA结合域识别靶DNA序列时，切皮内核酸酶或Cas9蛋白切割DNA，靶DNA双链断裂，然后激活DNA损伤修复机制，实现基因敲除、插入等。
图|ZFN，TALEN，CRISPR靶向切割DNA比较
它们在行动过程中也是相似的。通过DNA鉴定模块鉴定和键合特定的DNA位点，然后在相关核酸内裂解酶的作用下在特定位点进行切割，从而在细胞固有的HDR或NHEJ路径修复过程的帮助下，以特定序列插入，删除和合并基因。
图|ZEN，TALEN，CRISPR之间的差异比较
通过与其他技术进行比较，我们可以看到CRISPR/Cas9技术既有优势也有局限性。那么CRISPR/Cas9技术过去的生活有哪些故事呢？
基因编辑"魔术切割" - CRISPR
CRISPR于1987年由日本微生物学家Hiroshi Ishino首次发现。2012年Scribe Therapeutics的联合创始人Jennifer Doudna博士和Emmanuelle Charpentier博士使用CRISPR编辑了他们的基因。CRISPR被认为是21世纪最重要的发现之一，在2012年、2013年和2015年三次被评为科学界的"世界十大科学突破"。
簇状间隔短回声重复序列（簇状规则间隔短回文重复序列，CRISPR）是一种DNA重复序列，为细菌和古生物学提供对病毒和质粒的适应性免疫。CrispR基因序列主要由前导序列（前导序列）、重复序列和间隔序列（间隔序列）组成。2002年，Jansen的实验室命名了与CRISPR位点（CRISPR相关）相邻的基因，并发现了四个cas基因（cas1，cas2，cas3，cas4）。
CRISPR/Cas系统是原核生物的天然免疫系统。一些细菌在被病毒入侵后，能够在DNA中存储一小块病毒基因，称为CRISPR。当病毒再次入侵时，细菌可以根据它所写的片段来识别病毒，切断病毒的DNA并使其失效。
CrispR系统是I型，II型和III型，其中CRISPR / Cas9是研究最多的II型，是第3代基因编辑技术，遵循锌指核酸酶（锌指核酸酶，ZFN）和转录激活因子效应核酸酶（活化样对象核酸酶，TALEN）。其介导的基因编辑可用于生成转基因模型，调节转录，调节表观遗传学等。
CRISPR/Cas9系统主要由Cas9蛋白和单链向导RNA（sgRNA）组成，其中Cas9蛋白具有双链切割DNA功能，sgRNA充当向导。在存在原间隔相邻原型（PROtospacer相邻基序，PAM）的情况下，Cas9蛋白可用于在sgRNA引导下通过碱基互补配对到达不同的靶位点，切割DNA双链断裂（双断裂，DSB）的靶基因。
CRISPR/Cas9技术工作的3个关键因素
向导RNA：定位部分靶基因RNA。这是在实验室中设计的;
CRISPR相关蛋白9（Cas9）：切断"剪刀"不需要的DNA片段;
供体DNA：原始DNA链被切断后插入所需的DNA片段。
图|CRISPR - Cas9介导的基因组编辑图
DSB修复有两种主要机制，非同源连接端修复NHEJ和同源重组修复HDR。非同源末端连接（NHEJ），NHEJ介导的修复可以在DNA双链断裂位点产生不准确的可变长度插入和/或去除突变。还存在其他非同源重组修复途径，例如微均质端连接（MMEJ，微同源介导端连接）和单链退火途径（SSA，单链退火）。
NHEJ，MMEJ和SSA之间的差异在非同源修复的三种方式上是显着的。
/ NHEJ途径修复DSB损伤是通过直接连接末端来完成的，这不需要对大片段进行同源序列识别，但修复只需要1-5 bp碱基配对，这是一种容易出现故障的修复。
MMEJ修复和NHEJ修复路径之间最大的区别是所鉴定的同源序列的长度。MMEJ修复途径需要5-25个碱基同源序列，这通常导致连接处没有同源片段或基因重生。这也是容易出错的修复程序。
与NHEJ和MMEJ路径相比，SSA途径需要更长的同源序列（>30bp）进行鉴定。SSA通路可导致基因组的丧失，这与MMEJ通路相似。此外，SSA与同源重组途径类似，也被归类为同源序列依赖性的DSB修复模式，两者都需要5'至3'DNA剪切才能产生3'突出的单链DNA。
图|非同源修复的三种方法
同源定向修复（HDR），HDR介导的精确修复可以引入精确的点突变或从单链或双链DNA供体模板插入突变。同源重组的机理在双链DNA修复中具有重要的细胞生物学意义。DNA同源重组修复是一种复杂的信号通路，涉及多个步骤，关键蛋白为BRCA1和BRCA2。如果BRCA基因突变导致BRCA1和BRCA2蛋白丧失能力，则可导致HRD功能障碍（同源重组缺乏症，HRD）和PALB2，CDK12，RAD51，CHEK2，ATM等相关基因突变，或BRCA1基因启动子甲基化，导致基因组不稳定。当在同源重组中发生错误识别时，对非模板染色体进行"修复"会对细胞造成不可预测的损伤。例如，错误的识别来自另一个亲本同源对象，而不是姐妹染色单体作为"修复"受损染色体的模板。亲本和亲本染色体的DNA序列在很多地方是不同的，所以这种类型的修复可以将需要修复的DNA序列从亲本序列转换到母体序列，或者从亲本到母体序列。
图|同源重组通常导致基因DNA序列在染色体水平上互换
CrispR因其简单、廉价和高效而成为世界上最受欢迎的基因编辑技术，被称为编辑基因的"魔剪"。通过使科学家能够高效、精确地改变、编辑或替换植物、动物甚至人类中的基因，修饰后的CRISPR技术可以广泛应用于生物医学等领域。
CRISPR技术在许多技术应用和互用领域产生了重大影响，人们越来越关注安全性、道德规范和监管。
CRISPR技术应用前景广阔，有望在医疗保健、能源、农业和工业领域大放异彩
开发新的诊断测试，靶向药物和治疗方法。通过将CRISPR与其他可以切割靶DNA或RNA的Cas蛋白配对，然后切割其他分子以产生视觉信号，科学家可以确定病毒成分何时存在。科学家们正在利用这项技术开发诊断测试，以快速识别COVID-19等疾病。CRISPR / Cas9正在测试某些疾病的可能治疗方法，包括镰状细胞性贫血和某些类型的癌症。CRISPR还可用于通过改变昆虫或其他可以传播它们的生物的特性来帮助控制某些疾病。例如，科学家使用CRISPR使蚊子对导致疟疾的寄生虫更具抵抗力。
开发生物燃料。基因编辑可以提高藻类生物燃料的产量。使用CRISPR / Cas9技术，科学家们能够找到并去除限制脂肪产生的基因。Synthetic Genomics是一家美国生物技术公司，致力于为全球能源和环境问题开发商业基因组学解决方案，它创造了产生两倍脂肪的藻类，然后用它们来生产生物柴油。到目前为止，藻类还没有产生足够高的脂肪来支持生物柴油的大规模生产。借助CRISPR / Cas9技术，藻类有望在将二氧化碳转化为生物燃料方面显着提高效率。Synthetic Genomics目前正在与石油公司埃克森美孚（Exxon Mobil）合作。预计到2025年，该伙伴关系将实现每天生产10，000桶（石油计量单位，相当于120至159升）藻类生物燃料的目标。
更强壮、更抗病的作物。CRISPR可以通过增加营养，抗病性和在恶劣天气和土壤条件下的生存能力来改善农产品。在传统作物改良中，CRISPR技术可以提高产量、质量、抗病性和除草剂抗性。CrispR在与其他技术相关的创新正在农业育种和加速作物驯化方面出现。目前，CRISPR技术广泛应用于模型植物（变形虫、烟草）和一些主要作物，如水稻、小麦、玉米等。CRISPR技术还促进了植物基因功能的研究和预期农艺性状的选择。例如，当研究人员去除少量特定的黄瓜基因时，这些植物就不那么容易受到已知会损害植物并造成严重作物损失的病毒的影响。CRISPR的基因编辑和发明专家张峰教授、David Liu先生和Keith Joung先生共同创立了一家名为Pairwise的新农业公司。该公司致力于利用基因编辑技术，通过利用作物的自然多样性，以新的方式应对全球粮食挑战。
更先进的工业产品。CrispR的潜在用途正在各行各业进行探索。除了开发新的生物燃料事故外，能够拯救环境免受灾害的细菌和新材料是工业产品与CRISPR技术结合使用的主要方向之一。Caribou Bioscience是一家专注于CRISPR非治疗性应用的创新技术公司，提供基于CRISPR的工具，以改善工业发酵过程，并彻底改变化学品和酶的生产。他们还使用CRISPR来操纵微生物来产生新的化学物质。潜在的新型生物材料包括香料、香精和工业清洁产品。
图|CRISPR技术应用前景与挑战并存
CRISPR基因编辑也引发了人们对其安全性、伦理和监管的担忧。
安全问题。使用CRISPR可能会产生意想不到的后果。例如，它可以针对DNA中的"意外"位置，导致可能导致疾病或其他伤害的变化。虽然一些研究表明错误可能很少见，但它们仍然需要研究。此外，CRISPR活性可能会给细胞带来压力并阻止编辑。虽然有些细胞可以在DNA改变后恢复，但许多细胞不能。
道德问题。伦理问题包括CRISPR是否会被用来增强人类的特征，比如增加肌肉质量、学习能力和记忆力，以及使用所有人群是否公平。使用CRISPR编辑人类生殖的影响也引发了伦理问题。例如，遗传变化对后代的影响程度以及是否应该允许对人类胚胎进行研究。
监管挑战。许多国家很难确定如何监管CRISPR和其他基因编辑技术。例如，在美国，目前尚不清楚基因编辑作物是否会受到与传统转基因（GM）生物相同的法规的约束。虽然FDA自2017年以来一直在就其监管政策征求公众意见，但该技术的新行业指南已被推迟。在欧洲，2018年的一项法院裁决裁定，转基因作物将受到与转基因植物相同的法规的约束。在基因编辑技术的调控中还有很多问题需要解决。
病毒载体
病毒是一类可以有效感染人类细胞和其他动物细胞的微生物。病毒的能力是将其基因有效地导入宿主细胞，具有良好的基因递送效率。因此，该病毒已被科学家转化为基因治疗的主要传递工具。基因治疗中最广泛使用的病毒载体包括逆转录病毒（病毒，RV）和慢病毒（LV），腺病毒（腺病毒，Adv）和腺相关病毒（腺相关病毒，AAV）等载体。
逆转录病毒载体是RNA病毒，但DNA互补链可以在受感染的细胞内转录，可以作为模板合成第二条DNA链，可以掺入细胞基因组DNA中。病毒可以利用宿主细胞的酶进行自我转录和复制，RNA可以合成蛋白质，重新包装病毒，RNA从细胞中释放出来，成为传染性病毒，载体可以以不同的方式改变。介导的过程允许病毒单拷贝基因组稳定地进入细胞。
慢病毒属在分类上属于逆转录病毒家族，包括8种能够感染人类和脊椎动物的病毒，主要感染细胞以淋巴细胞和巨噬细胞为主，导致个体感染的发作。慢病毒载体是单链RNA病毒，最常用的病毒系统是四质系统。与其他逆转录病毒相比，慢病毒载体具有容纳更广泛，分裂和非分裂细胞的感染能力，表达稳定并构建为携带约5kb和更长的靶基因的特征。
腺病毒是一种没有细胞膜的线性双链DNA病毒，目前分为5个属。在临床和科学研究中，主要使用Adv5腺病毒载体。腺病毒载体系统一般以人病毒为载体，以人体细胞为宿主，属于非整合病毒载体，因此为人体蛋白质的准确翻译和加工以及适当的折叠提供了理想的环境。腺病毒载体还具有宿主范围广、对人类致病性低、增殖细胞和非增殖细胞中基因感染和表达、有效增殖痒高、不插入突变体、悬浮培养物扩增、同时表达多个基因等特点。
腺相关病毒是一类属于微病毒家族的单链线性DNA缺陷病毒。腺相关病毒基因组DNA小于5kb，无包膜，形状像暴露的20面颗粒。腺相关病毒载体具有安全性好、免疫原性低等优点，可感染分裂细胞和非分裂细胞，并能介导基因的长期稳定表达。因此，在神经系统的体内和体外研究中，腺相关病毒载体引起了很多关注。
目前，病毒载体仍然是临床试验中的主流载体。病媒的优点是转染效率高，但缺点包括无法特异性群体，包装能力有限，免疫原性强以及组织靶向性不足。其中，慢病毒宿主范围广，基因容量大，感染效率高，能将基因整合到宿主细胞中，实现长期稳定表达，常构建稳定菌株;
图|病毒载体技术的比较
当然，还有许多其他类型的病毒载体，如牛痘病毒（牛痘病毒，VV），简单孢子病毒（单纯疱疹病毒，HSV），噬菌体载体等。以HSV病毒为例，HSV病毒滴度高，宿主范围广，外源基因容量大，对神经细胞具有特异性，但其毒性和免疫原性有待进一步验证。因此，HSA病毒载体并未得到广泛使用。
非病毒载体
非病毒载体的原理是利用合成载体材料的理化性质来介导基因转移。与病毒载体相比，非病毒载体具有安全性高、包装尺寸大、免疫原性弱、靶向性可控等优点，与病毒载体相比，非病毒载体成本更低、制备更简单、大规模生产方便。在反义词寡核苷酸和其他特殊外源基因片段的表达中，病毒载体具有传统病毒载体不可替代的作用。
目前，所研究的非病毒载体主要包括脂质体、分子偶联受体、聚合物（聚-L-赖氨酸、聚乙烯次胺等）、复合载体和纳米颗粒载体。常用的基因转移脂质包括阳离子、中性和阴离子脂质，其中阳离子脂质是研究最广泛的，而基因转移中使用的无机纳米颗粒主要包括硅、碳纳米管、氧化铁等，它们主要通过细胞膜将药物或生物分子输送到生物体来治疗疾病。虽然非病毒载体仍然存在转染效率低等问题，但它们在基因治疗领域发挥着越来越重要的作用。
图|非病毒载体的特征
以脂质基、脂质样非病毒载体为例。阳离子脂质和脂质样载体可以通过静电相互作用加载核酸。目前，这种非病毒载体microRNA、siRNA和shRNA递送已得到广泛应用。同样，它们还可以提供基于质粒DNA、mRNA和RNP的CRISPR/Cas9系统。许多新结构和高性能脂质和脂质样材料是为载体结构而设计的，这些载体通常需要PEG修饰。脂质载体通过PEG修饰实现长周期，通过被动靶向可以在肿瘤组织中积累，其配体修饰或脂质结构修饰可以增强载体的靶向，促进细胞摄取，提高递送效率。这种载体在屏蔽载体中正电荷，减少蛋白质吸附，其循环稳定性也可以提高，更能满足人体给药的要求。
图|用于递送CRISPR/Cas9体系的非病毒载体
聚合物聚合物是通过短链重复单元的聚合形成的。重复单元的高度可控的结构特性允许根据所含物质的响应性精确设计聚合物。结构多样性和功能全面性使聚合物更有可能提供pDNA。
通常用于递送蛋白质的纳米载体包括胶体纳米颗粒（例如脂质和固体脂质纳米颗粒），聚合物纳米材料（例如聚合物膜，纳米胶囊和凝胶束），无机纳米载体（例如碳纳米管，量子点，介导管，磁性纳米颗粒，金纳米颗粒，金属有机框架，黑磷纳米芯片）等。磁性纳米颗粒可用作磁共振成像的造影剂;金纳米颗粒可以产生光热效应;量子点粒子可以进行示踪成像;一些纳米颗粒可以同时携带药物和基因。这些非病毒载体不仅有效地将基因药物递送到细胞中，而且还通过外部干扰达到最佳的抗癌效果。
虽然非病毒载体的优势显而易见，但在CRISPR/Cas9体系中非病毒载体的递送过程中仍存在许多问题，例如如何防止网状内皮系统（RES）的鉴定和去除，如何在特定位置实现纳米颗粒的富集，如何交叉由水磷脂细胞膜组成的水磷脂双分子层， 等。
可溶性微针辅助基因治疗，葡萄糖软质类固醇药物的递送呈现新路径
浙江大学药学院教授袁平教授使用高特异性Cas9核糖核蛋白（RNP）基因编辑技术，通过给予具有有效上皮微针的糖皮质激素，以有效的方式有效治疗炎症性皮肤病（ISD），标题为"微针辅助基因组编辑：靶向NLRP3的透皮策略"。CrispR-Cas9用于他们正在研究的协同作用，发表在科学子期刊《科学进展》（Science Advances）上。这项研究的结果使可溶性微针贴片基因编辑疗法进入视野。
炎症性皮肤病（ISDs）是最持久的疾病之一，通常以产生促炎细胞因子来激活先天性和适应性免疫反应。牛皮癣和特定皮炎（AD）等炎症性皮肤病正变得越来越普遍，是公共卫生的主要威胁之一。目前，患者只能从少量药物中进行选择，尽管糖皮质激素和免疫抑制剂是一线治疗选择，但大多数患者在长期治疗后对糖皮质激素产生耐药性，治疗效果有限。因此，替代治疗方案的开发是为对糖皮质激素产生耐药性的患者提供医疗解决方案的重要突破。
大多数研究表明NLRP3激活与糖皮质激素耐药性之间存在很强的相关性，尽管已经有许多关于干扰NLRP3上游相关因子激活以达到治疗目的的小分子抑制剂的研究，但口服给药后可到达下皮层的药物量非常有限，不能达到有效的治疗目的。因此，提高安全性和有效性已成为这一研发方向的重中之重。
Ping教授的团队开发了含有针对NLRP3的Cas9核糖核蛋白（RNP）纳米复合材料的可溶性微针（MN）贴片，以及含有Dex的纳米复合材料。当粘在皮肤中时，微针可以迅速溶解并释放两个纳米复合材料，然后被细胞和周围的免疫细胞内化，有效地治疗皮下炎症。微针通过皮肤输送Cas9 RNP和Dex纳米复合材料，破坏体外细胞NLRP3炎性胴体，并与Dex联合有效治疗特异性皮炎（AD）和牛皮癣。
当筛选sgRNA序列时，在CMAX（一种商业转染试剂）介导的DC2.4和3T3细胞中编辑NLRP3基因位点，Indel效率高达35.4%和32.5%，并通过Sanger测序确认。此外，实验发现，随着PLGA/Dex纳米复合材料加入DC2.4细胞，NLRP3基因组位点的内嵌效率从29.6%提高到36.2%。在3T3电池中，Indel效率也从19.1%提高到31.7%。结果表明，Dex纳米复合材料中的PLGA可以扩增细胞核孔，促进Cas9成核，并提高NLRP3基因位点的编辑活性。
通过微针介导的上皮治疗策略的梯度递送，基因编辑和葡萄糖皮质类固醇可以与治疗的治疗效果相结合， 最大化。该方法在炎症性皮肤病的治疗中不仅具有巨大的潜力，而且为透皮给药与基因编辑疗法的结合提供了新的思路。
因为目前在非病毒载体基因治疗领域的研究仍然大多在体外进行，体外结果存在一些差异。因此，未来非病毒载体基因治疗的发展将更多地与体内研究相关。
目前市场上非病毒产品的代表
新血管原
俄罗斯人类干细胞研究所于2012年推出的第一个非病毒基因治疗产品由编码内皮生长因子（VEGF-165）的质粒载体组成;和适应症：治疗严重的肢体缺血。
卤酸盐
由Anges Japan推出，已于2019年被批准用于Nhs。Collategene由pVAX1-HGF组成，其表达HGF728作为人体内的异构体。其主要适应症是治疗动脉粥样硬化和血栓性血管炎。
Spinraza （Nusinersen）
由Biogen和Ionis Pharmaceuticals在美国联合开发，将于2017年被FDA批准上市。它通过与SMN2基因转录形成的mRNA结合来改变RNA的剪接过程，从而增加正常SMN蛋白的表达。结果，该治疗可以增加SMN1基因失活SMA患者SMN蛋白的正常LEVEL，从而维持运动神经元的存活。其主要适应症是儿童和成人的脊髓性肌肉萎缩症。
非病毒和病毒载体都为各种应用实施了CRISPR/Cas9递送。基因治疗也从基础研究转向药物开发和工业生产。基因治疗在血肿和罕见疾病的治疗方面具有充足的市场空间，并在未来可用。随着研发水平和准备条件的提高，科研与临床需求的结合以及转化过程，未来在保险支付的支持下，基因治疗终将有一天走进老百姓家。
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