续写卵生动物克隆的可能

具有相似羽毛表形形式的个体出现在狼山鸡细胞"克隆"的后代中。扬州大学插画

记者李晨、记者于伟

自1997年多莉克隆绵羊问世以来，已有20多种哺乳动物实现了体细胞克隆的无性繁殖。但由于特殊的卵子繁殖模式，体细胞克隆方法不能用于家禽，因此家禽的保护、抢救、濒危恢复和生物工程育种遇到了瓶颈，并没有被打破。

近日，《自然通讯》在线刊登了扬州大学动物科学技术学院教授李碧春和陈国红的最新研究文章。本文介绍了将鸡细胞（成纤维细胞）逆转到原始生殖细胞中以繁殖后代的理论研究和方法体系。

破解家禽动物细胞克隆问题

该论文的合著者陈国宏告诉《中国科学日报》，哺乳动物体细胞克隆技术的原理是将重编程的体细胞移植到无核化的卵母细胞中，形成重建的胚胎，然后移植到代孕母亲体内继续发育，从而产生克隆动物，如克隆绵羊多莉。

"但这项技术不能在鸟类身上实施。文章合著者李碧春说。主要原因是"鸟类的受精卵（蛋）已经发育到具有大量细胞的高级囊胚阶段，并且与蛋黄紧密相连以吸收营养。"

除了卵母细胞（未受精卵）或早期胚胎（受精卵）外，卵子还含有胚胎发育所需的大量营养物质（蛋黄），家禽卵母细胞核较大，仅由薄薄的细胞质层包裹，这使得去除和转移到细胞核中的过程难以实施。

如果采用哺乳动物体细胞核移植方法，将胚胎重建植入卵子中，就相当于将"床"中的子宫胚胎取出，然后用重建胚胎代替继续发育。

"这个过程目前在产卵动物中是不可能的。"这使得家禽克隆不可逾越，这是一个瓶颈，阻碍了家禽业家禽遗传学，发育生物学和生物工程育种，物种资源保护和濒危鸟类恢复以及遗传分子机制等领域的研究，"该论文的作者张亚尼说。"

目前，我国拥有非常丰富的畜禽品种资源。陈国红认为，保护动禽品种资源是未来精细性状利用的基础，生物工程育种、挖掘和建立合适的育种体系尤为必要。

在哺乳动物中，无论是体细胞克隆还是配体和胚胎冷冻技术，都可以有效地保护现有的物种资源。但在鸟类中，这些方法并不完全适用，因此需要开发新的方法。

"我们的研究利用了鸡原始生殖细胞随血液迁移的特点，首先将供体细胞，即成纤维细胞，体外分化成原始生殖细胞，然后异基因移植到受体中，使其借用受体腺体的环境发育成精子或卵子，由受体鸡进行性成熟，相互交配， 从捐赠的鸡中产生后代。由于它与哺乳动物的超细胞克隆不同，我们称之为克隆状鸡。"李碧春说。

"克隆鸡的出现，不仅为家禽物种资源保护、濒危鸟类恢复提供新途径，也为未来家禽动物生物工程育种、性状遗传机制分析等基础研究工作提供新途径。"陈国红说。

实现溶血母细胞对原始生殖细胞的有效逆转

该团队于2010年开始研究克隆鸡。随着对鸡原始生殖细胞生物学特性的研究不断深入，他们发现鸡原始生殖细胞可以作为生产克隆鸡的工具细胞，但遇到了如何获得大量原始生殖细胞的问题。

虽然在哺乳动物中已经建立了诱导原始生殖细胞的有效体外方法系统，但尚未在家禽中建立。

左启生介绍，团队建立了原始生殖细胞迁移和后代鸡生产模式，为鸡种子资源的保护和恢复提供了新的思路。

但由于来自分离鸡的原始生殖细胞数量很少，并且以牺牲早期胚胎为代价，该团队一直在探索一种获得大量原始生殖细胞的方法。

他们首先建立了一个体外诱导胚胎干细胞分化成原始生殖细胞的系统，但胚胎干细胞并不容易获得。"体细胞重编程技术为我们提供了一个好主意，即体细胞被重新编程以形成具有类似于胚胎干细胞的分化潜力的诱导强效干细胞，并且体细胞分离和冷冻技术相对容易在短时间内大量获得，而不会对个体造成巨大伤害。左左说。

因此，他们选择了鸡成纤维细胞，首先将其重新编程为诱导的二能干细胞，然后进一步诱导分化成原始生殖细胞，这可以大大解决原始生殖细胞无法获得大量和分离培养困难的问题。

经过10多年的探索，研究小组将黑羽狼山鸡的体细胞逆转为原始生殖细胞，并将它们移植到隐性白羽白岩受体鸡（代孕鸡）中，从捐赠者黑羽狼山鸡中产生后代。

溶体母细胞随着活禽成为现实而恢复

"这项技术是体细胞恢复生命的新途径，是改变家禽生物工程育种和种子资源保护传统规律的创新，对家禽业的发展具有重要的现实意义。一位文章评论专家评论道。

"这项研究可以使用鸡的胚泡来产生后代，这种技术可能改变克隆鸡生产的游戏规则，并且在鸡肉研究中可能非常有用。另一位审稿人评论道。

经过探索，李碧春和陈国红的课题组还系统分析了鸡细胞重编程和原始生殖细胞发生的调控机制，建立了高效的体细胞重编程方法体系，诱导多能干细胞分化成原始生殖细胞和原代生殖细胞同种异体移植。

"结合这三种技术，成功地将溶血母细胞恢复到活禽中。这项工作突破了家禽基因工程运行困难瓶颈，为家禽保护和濒危物种恢复提供了理论依据和技术支持。未来，结合基因编辑技术，可以有效获得基因修饰后代，加快家禽生物工程育种过程。李碧春介绍。

目前，该团队还建立了快速有效的鸡皮组织冷冻保存技术体系，可以从解冻复苏的皮肤组织中获得细胞并诱导它们进入原始生殖细胞，为家禽物种资源的长期保存提供技术支持。

来源：中国科学学报