續寫卵生動物克隆的可能

具有相似羽毛表形形式的個體出現在狼山雞細胞"克隆"的後代中。揚州大學插畫

記者李晨、記者于偉

自1997年多莉克隆綿羊問世以來，已有20多種哺乳動物實作了體細胞克隆的無性繁殖。但由于特殊的卵子繁殖模式，體細胞克隆方法不能用于家禽，是以家禽的保護、搶救、瀕危恢複和生物工程育種遇到了瓶頸，并沒有被打破。

近日，《自然通訊》線上刊登了揚州大學動物科學技術學院教授李碧春和陳國紅的最新研究文章。本文介紹了将雞細胞（成纖維細胞）逆轉到原始生殖細胞中以繁殖後代的理論研究和方法體系。

破解家禽動物細胞克隆問題

該論文的合著者陳國宏告訴《中國科學日報》，哺乳動物體細胞克隆技術的原理是将重程式設計的體細胞移植到無核化的卵母細胞中，形成重建的胚胎，然後移植到代孕母親體内繼續發育，進而産生克隆動物，如克隆綿羊多莉。

"但這項技術不能在鳥類身上實施。文章合著者李碧春說。主要原因是"鳥類的受精卵（蛋）已經發育到具有大量細胞的進階囊胚階段，并且與蛋黃緊密相連以吸收營養。"

除了卵母細胞（未受精卵）或早期胚胎（受精卵）外，卵子還含有胚胎發育所需的大量營養物質（蛋黃），家禽卵母細胞核較大，僅由薄薄的細胞質層包裹，這使得去除和轉移到細胞核中的過程難以實施。

如果采用哺乳動物體細胞核移植方法，将胚胎重建植入卵子中，就相當于将"床"中的子宮胚胎取出，然後用重建胚胎代替繼續發育。

"這個過程目前在産卵動物中是不可能的。"這使得家禽克隆不可逾越，這是一個瓶頸，阻礙了家禽業家禽遺傳學，發育生物學和生物工程育種，物種資源保護和瀕危鳥類恢複以及遺傳分子機制等領域的研究，"該論文的作者張亞尼說。"

目前，我國擁有非常豐富的畜禽品種資源。陳國紅認為，保護動禽品種資源是未來精細性狀利用的基礎，生物工程育種、挖掘和建立合适的育種體系尤為必要。

在哺乳動物中，無論是體細胞克隆還是配體和胚胎冷凍技術，都可以有效地保護現有的物種資源。但在鳥類中，這些方法并不完全适用，是以需要開發新的方法。

"我們的研究利用了雞原始生殖細胞随血液遷移的特點，首先将供體細胞，即成纖維細胞，體外分化成原始生殖細胞，然後異基因移植到受體中，使其借用受體腺體的環境發育成精子或卵子，由受體雞進行性成熟，互相交配， 從捐贈的雞中産生後代。由于它與哺乳動物的超細胞克隆不同，我們稱之為克隆狀雞。"李碧春說。

"克隆雞的出現，不僅為家禽物種資源保護、瀕危鳥類恢複提供新途徑，也為未來家禽動物生物工程育種、性狀遺傳機制分析等基礎研究工作提供新途徑。"陳國紅說。

實作溶血母細胞對原始生殖細胞的有效逆轉

該團隊于2010年開始研究克隆雞。随着對雞原始生殖細胞生物學特性的研究不斷深入，他們發現雞原始生殖細胞可以作為生産克隆雞的工具細胞，但遇到了如何獲得大量原始生殖細胞的問題。

雖然在哺乳動物中已經建立了誘導原始生殖細胞的有效體外方法系統，但尚未在家禽中建立。

左啟生介紹，團隊建立了原始生殖細胞遷移和後代雞生産模式，為雞種子資源的保護和恢複提供了新的思路。

但由于來自分離雞的原始生殖細胞數量很少，并且以犧牲早期胚胎為代價，該團隊一直在探索一種獲得大量原始生殖細胞的方法。

他們首先建立了一個體外誘導胚胎幹細胞分化成原始生殖細胞的系統，但胚胎幹細胞并不容易獲得。"體細胞重程式設計技術為我們提供了一個好主意，即體細胞被重新程式設計以形成具有類似于胚胎幹細胞的分化潛力的誘導強效幹細胞，并且體細胞分離和冷凍技術相對容易在短時間内大量獲得，而不會對個體造成巨大傷害。左左說。

是以，他們選擇了雞成纖維細胞，首先将其重新程式設計為誘導的二能幹細胞，然後進一步誘導分化成原始生殖細胞，這可以大大解決原始生殖細胞無法獲得大量和分離培養困難的問題。

經過10多年的探索，研究小組将黑羽狼山雞的體細胞逆轉為原始生殖細胞，并将它們移植到隐性白羽白岩受體雞（代孕雞）中，從捐贈者黑羽狼山雞中産生後代。

溶體母細胞随着活禽成為現實而恢複

"這項技術是體細胞恢複生命的新途徑，是改變家禽生物工程育種和種子資源保護傳統規律的創新，對家禽業的發展具有重要的現實意義。一位文章評論專家評論道。

"這項研究可以使用雞的胚泡來産生後代，這種技術可能改變克隆雞生産的遊戲規則，并且在雞肉研究中可能非常有用。另一位審稿人評論道。

經過探索，李碧春和陳國紅的課題組還系統分析了雞細胞重程式設計和原始生殖細胞發生的調控機制，建立了高效的體細胞重程式設計方法體系，誘導多能幹細胞分化成原始生殖細胞和原代生殖細胞同種異體移植。

"結合這三種技術，成功地将溶血母細胞恢複到活禽中。這項工作突破了家禽基因工程運作困難瓶頸，為家禽保護和瀕危物種恢複提供了理論依據和技術支援。未來，結合基因編輯技術，可以有效獲得基因修飾後代，加快家禽生物工程育種過程。李碧春介紹。

目前，該團隊還建立了快速有效的雞皮組織冷凍儲存技術體系，可以從解凍複蘇的皮膚組織中獲得細胞并誘導它們進入原始生殖細胞，為家禽物種資源的長期儲存提供技術支援。

來源：中國科學學報