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2020年4月，中国科学院神经科学研究所研究员杨辉发表了一篇关于细胞的研究论文。2020年7月，加州大学包校向董教授举报杨辉"抄袭、涉嫌欺诈等学术道德不端行为"。在中国国内学术界引起轰动。2021年2月1日，来自哈佛大学、霍普金斯大学等大学的教授，包括美国科学院院士，发表了一篇提出各种问题的文章。国内外的神经科学家在本文中已经大声疾呼。
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写作|D.A.A.A
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2020年7月，一封举报信在网上发布。加州大学圣地亚哥分校细胞与分子医学系教授傅辉实名报道，中国科学院神经病学研究所、科技部和基金委员会研究员杨辉实名称，称其为"抄袭和涉嫌学术不端行为"。被质疑的杨辉的论文于2020年4月30日发表在《细胞》杂志上。
从那以后，傅向《知识分子报》证实，他确实在与神经沟通后送达了报告信，希望能提供DNA引物订单的证据。虽然杨辉也通过其他媒体做出了回应，但傅香东认为"明显避免了轻盈的重量，过度装饰"。言下之意，对他的提问没有正面回应。
几个月后，随着两人之间的争执平息下来，神经再生领域的几位专家继续发表文章，怀疑杨辉在Cell论文中看到的可能是假的，有些结论需要反复独立检验。
那么，有什么怀疑呢？
<h1类""pgc-h-right-arrow"数据跟踪""25">01直接"矛盾"</h1>
视网膜和不同细胞类型的分层结构，图中红色代表视网膜细胞，蓝色代表视网膜细胞，棕色代表视网膜神经细胞，紫色代表视网膜毛勒细胞的主要神经胶质细胞之一。
照片 维基百科 https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Retina_layers.svg
在三种最常见的视网膜疾病中，年龄黄斑变性和糖尿病性视网膜病变可导致视网膜和视锥细胞作为光敏物的丧失;这三个视网膜神经元的丧失导致大多数不可逆的眼盲。仅在美国，这三种疾病就折磨着近1500万人，并且随着人口老龄化，它们的患病率正在增加。
好吧，如果有一种治愈方法可以再生这些丢失的视网膜神经元，那么它具有重要的临床意义。
2020年4月，澳门科技大学教授张康和傅向东发表了一篇论文，发现Muller细胞被转化成视锥细胞，并且在轻拍视网膜神经胶质细胞中蛋白PTP1的表达后，视锥细胞中涉及的光反应显着恢复。
4月30日发表的杨辉细胞论文使用不同的技术来降低Muller细胞中相同PTP1的表达，但将Muller细胞转化为视网膜神经细胞。
在2021年2月1日出版的《临床研究杂志》上，约翰霍普金斯大学教授塞思·布莱克肖（Seth Blackshaw）和哈佛大学教授乔希·萨内斯（以下简称JCI）发表了一篇评论文章，两人研究了最近出现的一些"力"研究，发现了一些矛盾，包括涉及这两项研究的矛盾。 作者指出。
这一切都降低了PTBP1在视网膜毛勒细胞中的表达，但Muller细胞被转化为不同类型的神经元 - 一个视网膜细胞和一个视网膜神经细胞 - 这需要解释。
Blackshaw和Sanes都是视觉系统发育，损伤和再生方面的资深专家，后者是美国科学院院士。
事实上，除了JCI文章指出这一点外，傅向东在2020年6月24日发表的《自然》论文部分结论与杨辉这篇Cell论文的矛盾更为直接。
例如，傅湘东利用RNA干扰技术降低PTPP1基因的表达，在帕金森病小鼠中，大脑的黑质密集部分，将星型神经胶质细胞转化为多巴胺神经元，并进一步投射到纹状体上。
另一方面，杨辉使用基因编辑技术直接在帕金森小鼠大脑的纹状体区域降低PTBP1基因的表达，将星形神经胶质细胞转化为多巴胺神经元。
然而，除了中脑之外，傅湘东在其他大脑区域也做了更多的测试，发现敲低小鼠纹状星形神经胶质细胞中的PTPP1并不能再生多巴胺神经元。
这与杨辉的结论直接冲突。
"百分之九十五的纹状体是GABA能神经元，所有具有转导性的文章都产生这些神经元，只有通过添加多巴胺特异性因子才能获得一定量的多巴胺能量神经元。有经验的人一眼就能看出，杨辉的细胞就是死细胞。众所周知，抗体很容易附着在死细胞上，导致不合情理的结论。傅向东对知识分子说。
杨辉的研究结果也让其他神经科学家感到惊讶。
"纹状体中的神经元主要是GABA能神经元（神经元），在这样的微酶中，纹状体的神经胶质细胞理论上更有可能成为GABA能神经元。如果你想成为一个多巴胺神经元，我认为你应该需要一些特定的因素来推动它。暨南大学粤港澳中央神经再生研究所教授陈功告诉知识分子。
他进一步指出，如果多巴胺神经元在纹状体中再生，重要的是要了解这些原本不存在的，突然发生的多巴胺神经元是否可能对纹状体的局部神经回路甚至更广泛的脑神经回路产生不利影响。
<h1级"pgc-h-right-arrow"数据跟踪"25">02"疯狂的长"轴突？</h1>
除了这些直接的矛盾，杨辉的论文还有其他令人惊讶的事情。
在他的论文中，Muller细胞不仅转化为视网膜神经节点细胞，而且新的细胞轴突能够通过视神经迅速投射到外膝核（LGN）和上丘（SC）上，并修复模型动物损伤的视觉功能。
JCI的作者警告说，成年哺乳动物视网膜中轴突化视网膜神经细胞的再生效率相对较低，再生轴突的数量有限，很少达到中心目标。
杨辉细胞论文的屏幕截图，视网膜神经细胞轴突穿过视神经，将视网膜外的视觉信号传递到大脑的外膝核（LGN）和上丘陵（SC）区域。
"轴增长比其他中间状态更长，应该更容易观察和记录。对于长距离轴突投射神经元，新神经元的产生只是功能恢复的第一步，而轴突生长、引导、突触形成和髓鞘形成在每一步都是必不可少的。约翰霍普金斯大学医学院教授周凤泉告诉知识分子，在轴突再生领域，正确引导轴突的再生回到成年动物神经系统中的原始目标仍然是一个挑战，缺乏许多发育指导因素和支持性外部环境。
在2020年12月发表在《FEBS杂志》上的一篇综述文章中，周凤泉在论文中解释说，杨辉论文中新产生的视网膜神经细胞的轴突生长得太快，数量太多。
"在两周内，杨辉研究了新产生的视网膜神经细胞的轴突，这些细胞从外核层（ONL）生长到中脑的上丘陵。每周生长7.5毫米，大多数轴突再生研究，达到视觉交叉四周后，每周只有1毫米长，并且到视觉交叉点的大多数再生轴突找不到靶脑核心视网膜神经细胞的路径，只有极少数的轴突再生才能实现，那些确实可以延伸轴突， 在视网膜神经切片细胞层移植3周后，只有数量非常有限的视网膜神经队列细胞将轴突延伸到视网膜视神经的出口，远离视网膜交叉口和上山。"
傅湘东认为，杨辉的工作认为，视神经可以以正常发育速度的十倍生长，"完全违背了科学常识"。"
<h1类""pgc-h-right-arrow"数据跟踪""25">03看到错觉了吗？</h1>
如何解释这些矛盾甚至反常识的现象？神经胶质细胞真的会转化为神经元吗？
在研究了已经出现的许多神经原位再生研究之后，JCI的两位作者周凤泉和许多其他业内专家意识到，需要更多的测试来改善证据链，以消除错觉。
JCI的作者列出了三种可能的"错觉"，图B表明神经胶质细胞可能没有转化为新的神经元。图为参考文献1论文的截图。
首要任务是"渗漏"问题。
我们的大脑，如视网膜，有两种主要类型的细胞，神经元和神经胶质细胞。这些实验的总体目标是将一些神经胶质细胞转化为神经元，流行的方法是使用病毒向神经胶质细胞提供专门用于干预的工具包（包括启动子），这些神经胶质细胞还携带荧光蛋白基因来跟踪这些神经胶质细胞。通过这种方式，原则上，可以看到哪些神经胶质细胞实际上成为神经元。
然而，理想与现实之间存在差距，在实践中，一些试剂盒的设计并不能保证只有神经胶质细胞才会作或标记。
"这意味着你认为你正在设计一种反应，应该在神经胶质细胞中100%，但它并不完全是这样，你使用的病毒滴度越高，它就越有可能在神经元中，所以如果你使用过多的病毒，你可能会看到应该直接在神经胶质细胞中表达的荧光蛋白， 所以你认为你已经看到了过渡后的新神经元，但也许只是原始的神经元。陈功解释道。
就泄漏而言，周凤泉认为，杨辉等人实验中使用的AAV病毒和GFAP启动子在特异性上存在问题。
"第一种AAV病毒本身感染视网膜中不同类型的细胞，包括神经细胞（RGC）和神经胶质细胞，如Muller细胞。同时，Muller神经胶质细胞的特异性基因编辑主要是通过使用GFAP神经胶质细胞特异性启动子，但GFAP启动子神经胶质细胞特异性不是100%可靠的。含有GFAP启动子的基因也可能在神经元细胞中表达。他说。
不过，陈工也告诫说，漏液的存在不应该被神经胶质细胞分化成神经元的可能性完全否定。
在实践中，他的团队和国际上的许多其他团队已经使用逆转录病毒来证明神经胶质细胞的跨分化，因为逆转录病毒仅靶向分裂的神经胶质细胞，并且不会泄漏到非分裂神经元中。他的团队还使用神经胶质细胞谱系示踪剂来证明预先标记的神经胶质细胞确实可以转化为神经元。
"因此，重要的是要全面客观地评估原位神经再生的新技术，而不是因为有人做了错误的实验而杀死整个领域。他说。
作为该领域的先驱，陈公也发表了文章，澄清了一些评论。在他看来，虽然AAV有泄漏现象，但只要滴定滴定降比较低，泄漏率可以降低很低——
"我们通常建议将假阳性率降低到5%或更低，滴度为1x108-10GC / ml。一些实验室使用过量的AAV，例如滴度超过1x1013GC / ml的实验室，这是引起高滴定引起的假阳性的原因。一些实验结果需要第三方验证。"
然而，奇怪的是，没有观察到泄漏，尽管杨辉的Cell论文中使用的不同AAV是1013的"高"滴度。
< h1类"pgc-h-right-arrow"数据跟踪""25">04缺少中间状态？</h1>
另一种表明确实发生了转变的方法是证明中间状态的存在。
想象一下，神经胶质细胞向神经细胞的转变不可能瞬间发生，必须经过一些中间过程和状态——细胞的形态可能会发生变化，细胞的位置逐渐迁移，细胞的内部分子和功能也在逐渐变化。
在此前的报道信中，傅向东指出，杨辉细胞的论文缺乏中间转化状态。
杨辉的Cell论文于4月在网上发表后，许多神经生物学家立即质疑其数据的质量和可靠性，指出该论文没有确凿的证据来诱导细胞迁移，细胞形态和基因表达的逐渐转变，以及新获得的神经电生理特性。通俗地说，如果没有一系列关于细胞转移过程的实验数据的支持，很难说他们的结论是真实可靠的，也不能排除他们所看到的积极结果是基于实验室般的实验幻觉。"
傅湘东认为，支持杨辉结论的大部分证据很可能是由于内源性神经元中GFAP-CRE的表达泄漏。
神经胶质细胞向神经元的转变过程伴随着形式，转录组和位置的迁移变化。（图片来自参考文献2论文截图）
那么，你怎么能令人信服呢？
"这就像一个人从10楼乘电梯到1楼，总是往下一层，而不是一下子跳到一楼。在小鼠和猕猴的大脑皮层中，我们的团队观察到恒星型神经胶质细胞转化为神经元的中间状态，即具有部分神经胶质细胞特性和神经元某些特性的早期细胞的转化，这种中间状态的存在是细胞间分化的有力证据，"陈解释道。
周凤泉还建议，应尽可能密集地捕捉中间状态的转变。
例如，视网膜中的苗勒神经胶质细胞和视网膜神经胶质细胞分布在不同的层中，这种转化意味着Muller神经胶质细胞一步一步地"爬行"到目的地，并且细胞形态和转录组经历逐渐的变化（单细胞测序可用于最终，新转化的视网膜神经节点细胞需要进一步跟踪其轴突生长， 准确地投射到相应的大脑区域，并执行正常功能（目前的脑组织清洁和深度3D成像技术也是如此）。
< h1级""pgc-h-right-arrow"数据跟踪""25">05需要重复</h1>
质疑和批评是常态，也是进步的源泉，尤其是在面对复杂的新兴领域时。很多时候，区分事实和谎言并不容易，但"真实报道"是基本规范和底线。
尽管受到各种批评，但许多研究声称可以减轻或治疗动物模型中的一些神经系统疾病。显然，基础研究的结果越可靠，就越有利于后期的临床转化。杨辉等人报道的"有吸引力"的结果，无论是治疗神经性失明还是帕金森氏症，都不足为奇，如果这是一个不重要的结果，也很少有竞争。
同样面临JCI提问的张康告诉《知识分子》杂志，"选择rd10只四个月大以上的小鼠，这些小鼠已经无法检测到光敏细胞和视网膜电报信号，再加上GFAP-CRE跟踪系统，我们相信由此产生的光敏细胞和功能是由Muller神经胶质细胞转化的。
他还承认需要在后期改进体内跟踪系统，包括使用更长或全长的GFAP启动子、双cre，建立严格的对照组，足够密集的采样时间点和全面的分析手段，逐步跟踪穆勒神经胶质细胞到神经细胞的转化过程，对形成的细胞进行全面分析，证明所见的神经细胞实际上来自穆勒神经胶质细胞。
傅向东还告诉《知识分子》，他们正在设计实验，以充分解决AAV泄漏问题，以回应JCI的提问。
在撰写本文时，杨没有回复知识分子的电子邮件询问。
"我敢肯定，在这样一场风大雨飘摇的研究中，会有重复，只有重复才能做出最后的判断。"陈公说。
资源：
1.傅湘东的第一反应：与神经研究所杨辉的争执论文，http://zhishifenzi.com/column/depthview/9770?category=depth
2. 塞思·布莱克肖， 约书亚·R·萨内斯.将铅转化为黄金：重新编程视网膜细胞以治愈失明。J Clin Invest.2021;131（3）：e146134.https://doi.org/10.1172/JCI146134。
3. 钱超， 董斌， 王志毅， 周福奎.体内神经胶质转分用于中枢神经系统的神经元置换和功能恢复。2月S J. 2020 12月22.doi： 10.1111/febs.15681.Epub 提前印刷。PMID：33351267。
4. 傅某等通过内源性球状体再编程[预印本]在遗传性盲鼠中恢复视觉功能。https://doi。org/10.1101/2020.04.08.030981.发表于 bioRxiv April 8， 2020.
5. 周华等通过CRISPR-CasRx将神经胶质细胞转化为神经元可缓解小鼠神经系统疾病的症状。细胞。2020;181（3）：590–603.e16.
6. 钱汉， 康晓， 胡， J. 等.用原位转换的黑神经神经元逆转帕金森病的模型。自然 582， 550–556 （2020）.https://doi.org/10.1038/s41586-020-2388-4
7. 葛立杰， 杨， 等 （ 2020）.体内神经再生通过基于NeuroD1 AAV的基因疗法治疗成年非人灵长类动物的缺血性中风。细胞和发育生物学前沿 8，590008。
8. 项志军， 徐磊， 刘明， 王， Q.， 李伟， 雷伟， 陈国强 （ 2021）.小鼠皮层中直接星形胶质细胞到神经元转换的谱系追踪。神经再生研究16，750-756。
9. 郭志， 张磊， 吴志， 陈， Y.， 王芳， 陈， 陈， G. （2014）.在脑损伤后和阿尔茨海默病模型中，将反应性神经胶质细胞直接重编程为功能神经元。细胞干细胞14，188-202。