柑橘树病毒研究最新进展，专家解读

柑橘树病毒研究最新进展，专家解读

周 彦

柑桔衰退病毒(citrustristezavirus , CTV )引起的柑桔衰退病是一种重要的柑桔病害,自1860 年首次在澳大利亚有记录以来,在世界各柑桔主产地都有发生,对巴西、委内瑞拉、阿根廷、美国、南非等国的柑桔产业造成过毁灭性打击 。截至 20 世纪 90 年代,全世界已有超过1 亿株柑桔因感染柑桔衰退病死亡 。近年来,大陆江西、四川、云南、湖南、广西等柑桔主产区茎陷点型柑桔衰退病频发,对当地柑桔产业造成了严重损失 。本文就该病的相关研究作一综述,以期为今后开展柑桔衰退病研究和防控提供参考。

1 寄主范围

在自然条件下,CTV 主要为害芸香科 Citrus (柑桔属)、 Poncirus (枳属)和 Fortunella (金柑属)植物。在实验条件下,CTV 亦可感染芸香科 Aegle (木桔属)、 Aeglopsis (拟硬皮桔属)、Afraegle 、 Atalantia (酒饼勒属)、 Citropsis (樱桃桔属)、 Clausena (黄皮属)、 Eremocitrus (澳沙檬属)、 Hesperthusa 、Merrillia (茉莉果属)、 Microcitrus (澳指檬属)、 Pamburus (灰叶桔属)、Pleiospermium (东方橙属)、 Swinglea (菲律宾木桔属)等植物 ,以及非芸香科的Passifloracaerulea (蓝花西番莲)、 P . gracilis (细柱西番莲)和 Nicotianabenthamiana (本生烟 )等植物 。

2 衰退病类型及其为害

根据砧穗组合以及品种的不同,衰退病被分为了 3 种类型。

(1 )速衰型衰退病:引起以酸橙、香橼做砧木的甜橙、宽皮柑桔和葡萄柚死亡。根据发病速度又分为速衰型和一般衰退型 。速衰型衰退病是南美洲、加勒比海地区,以及美国、南非、西班牙等国柑桔衰退病的最主要类型 。大陆不使用或少使用酸橙、香橼砧木,且主要种植耐病的宽皮柑桔,因此仅在云南建水、宾川曾有速衰型衰退病发生的零星报道 。

(2 )茎陷点型衰退病:该类型与使用的砧木品种无关,主要发生于来檬、葡萄柚、桔橙、大部分柚类和某些甜橙(如锦橙、脐橙、佩拉甜橙)类型。病株木质部表面出现棱形、黄褐色大小不等的蜂窝状陷点,甚至充胶,导致枝条易折、植株矮化、树势减弱、果实变小、品质降低。茎陷点型衰退病是大陆、澳大利亚、日本等国柑桔衰退病的主要类型 。

(3 )苗黄型衰退病:在控温条件下引起酸橙、尤力克柠檬、葡萄柚和道县野桔实生幼苗出现严重矮缩和黄化 。

3 株系分化

CTV 存在复杂的株系分化现象,根据其基因组序列的差异, CTV 被分为了 T36 、 T30 、VT 、 T3 、 T68 、 RB 、 S1 和 HA16-5 等多个主要的基因型,并且随着深度测序技术的不断发展和完善,越来越多的 CTV 基因型被陆续发现 。其中,T36 基因型与速衰症状相关联,T3 、 VT 、 RB 和 T68 基因型与茎陷点症状相关联, VT 基因型与速衰和茎陷点相关联, S1 和T30 基因型通常不引起明显的症状 。但近年来的研究发现,一些相同基因型的CTV毒株其生物学性状也存在差异,且田间 CTV 毒株常含有多个基因型,因此难以仅凭基因型来准确判断 CTV 毒株的生物学性状 。此外,由于CTV 全序列测定的难度仍较大,因此开放读码框( ORF )1a , 5 ’非翻译区( UTR ),依赖 RNA 的 RNA 聚合酶( RdRp )等区域常被作为CTV 分型的重要靶标,其中又以 ORF1a 的多样性最为丰富,是目前使用较多的 CTV 分型依据 。

4 流行规律

CTV 主要通过嫁接和多种蚜虫以非循环型半持久方式进行传播,其中 Aphiscitricida(褐色桔蚜)的传毒能力最强,可高效传播 CTV 的多种株系,尤其是其他蚜虫不易传播或具有潜在危害的 CTV 强毒株,因此褐色桔蚜是导致外来 CTV 强毒株入侵,并迅速流行的重要原因之一 。 A .gossypii (棉蚜)和 A . spiraecola (绣线菊蚜)的传毒能力较弱,但因其在田间发生量大,因此也是 CTV 重要的传播媒介 。 A .craccivora (豆蚜)、 A . aurantii (桔二叉蚜)、 Myzuspersicae (桃蚜)和 Dactynotusjaceae (指管蚜)亦可传播CTV ,但其传播能力很弱 。此外,在实验条件下,CTV 还可以通过刀割和两种菟丝子( Cuscutasubinclusa 和 C .americana )进行传播。

5 病毒起源

喜马拉雅山东南山麓是柑桔的起源中心,目前绝大多数柑桔栽培品种都是香橼、宽皮柑桔和柚等 3 个柑桔最早类型的杂交后代 ,鉴于CTV 在香橼、宽皮柑桔和柚上多无明显症状,由此推测 CTV 可能起源于喜马拉雅山东南山麓柑桔原生区域内的野生柑桔,然后与柑桔共同进化 。 Liu 等 (2021 )对在中国云南哀牢山区野生柑桔自然生态中采集的 CTV 毒株进行了分析,其结果首次为 CTV 起源于中国,并随繁殖材料逐渐扩散至其他国家的假说提供了重要的理论依据。

6 病毒蛋白功能

CTV 是长线形病毒属( Closterovirus )成员,构成其基因组的正义单链 RNA 链包装于2000nm×11nm 螺旋对称的线形粒体中,是已知基因组最大的植物病毒。 CTV 的基因组含有 12 个 ORFs ,能够编码 17 种分子量为 6~401kDa 的蛋白 。其中,ORF1a 中由木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶串联结构构成的 L1 和 L2 结构域与病毒的积累、复制以及建立初次侵染点有关,且缺失 L2 结构域的 CTV 突变体比野生型 CTV 具有更广的寄主范围 。 ORF2编码的非保守多功能蛋白 p33 是目前 CTV 蛋白功能研究的热点。 p33 蛋白 C 端的跨膜结构域与 CTV 的寄主范围有关 。由于 p33 分布于植物的胞间连丝和细胞质囊泡,并能利用细胞分泌途径和肌动蛋白网络进行细胞内运输,还能寡聚形成小管结构,影响病毒在酸橙和柠檬中的移动效率,因此其可能具有非典型移动蛋白的功能 。除了参与病毒的移动、运输外,p33 还与 L1 和 L2 共同参与了 CTV 毒株间的交叉保护作用 。近年来的研究还显示,p33是蚜虫传播 CTV 的必要条件 。此外,p61、热休克蛋白 70 同源物(p65)、次要外壳蛋白(CPm )和主要外壳蛋白( CP )与病毒的组装、移动有关。 p33 、p18 和 p13 影响 CTV 侵染酸橙、柠檬、葡萄柚和克里迈丁桔等柑桔品种的能力 。 p23 作为一种RNA 结合蛋白,调控 CTV 复制过程中正负链 RNA 的比例,并与苗黄症状的产生,以及病毒的致病力有关 。p23 、 CP 和 p20 还具有 RNA 沉默抑制子的活性 。

在 CTV 复制过程中,除 5' 端的基因可被直接翻译外,3' 端 10 个基因的合成都需要有相同3' 末端的亚基因组 RNA ( sgRNA )作为 mRNA 的参与,并且越靠近 3' 末端,基因的表达量也相应增加,但 CP 的表达量高于更靠近 3' 末端的 p 13 和 p 18。此外,3' 端基因的表达量还受转录起始 位 点 +1 移 码、基 因 上 游 调 控 元 件 种 类 以 及 基 因 上 游 是 否 存 在 NTR 等 因 素 的影响 。

7 病毒 - 植物互作

由于 CTV 分布于植株的韧皮部,且柑桔生长缓慢,因此 CTV- 植物互作研究的难度大,目前常用模式植物本生烟来进行相关研究 。 Ruiz-Ruiz 等 (2018 )发现, CTV-p23 通过与甘油醛 3- 磷酸脱氢酶( GAPDH )在本生烟细胞质和胞间连丝处的互作,调控 CTV 正负义 RNA分子的复制比例,以及 CTV 在细胞间的运动,进而加快 CTV 的发病进程。同时,p23 还通过与 fk506 结合蛋白( FKBP17-2 )互作,将其从本生烟叶绿体转移到胞间连丝,进而下调NbFKBP 17-2mRNA 的表达水平,抑制本生烟中 CTV 的积累。此外,p23 还能引导 CP /NbFKBP17-2 复合物沿细胞壁移动。 CTV与寄主蛋白间的互作还会减弱寄主的抗病毒反应。例如,CTV 长链非编码的 sgRNALMT1 可以通过诱导产生一种替代氧化酶 AOX-1a ,抑制水杨酸(SA )介导的防御途径和活性氧( ROS )积累,从而促进 CTV 在植株中的增殖 。CTV 编码的沉默抑制子 p20 、 CP 通过与 RNA 沉默机制的关键成分 AGO1 和 AGO4 互作,抑制寄主的 RNA 沉默反应,促进 CTV 的侵染 。

p33 作为 CTV 重要的多功能蛋白,在 CTV-寄主互作中也发挥了重要的作用。 Sun 等 (2019 )发现, p33 可以诱导植株中 ROS 的积累,同时激活植物防御相关基因的表达和程序性死亡(PCD )的发生,进而抑制 CTV 侵入植物韧皮部组织,减轻症状的发生。进一步研究表明,p33 诱导产生的与寄主防御反应相关的类似神奇蛋白(MLP2 )通过识别并劫持 p33 ,从而抑制 CTV 在寄主中的移动;同时, CmMLP2 具有重组寄主膜系统的能力,通过合并内质网和高尔基体,诱导寄主应激反应和 ROS 积累,抑制 CTV 的复制 。此外,p33 还通过与 CP 、p23 和 p20 互作,减弱植株基于 RNA 沉默的抗病毒反应 。

8 茎陷点形成机理

CTV 的致病机理一直是研究焦点之一,但是由于难以监测植株中 CTV 的移动规律,以及病害发展的过程,因此相关研究进展较为缓慢,目前主要集中于茎陷点形成机理的研究 。

Schneider 等(1957 )通过对感染 CTV 的植株进行解剖观察推测,茎陷点的形成可能与形成层受到破坏,同时正常木质部和韧皮部细胞生长受阻有关。 Brlansky 等 (2002 )认为 CTV侵入韧皮部细胞后,在木质部凹腔中形成、积累的胶状物质与茎陷点的形成有关。 Tatineni等 (2008 )推测,茎陷点症状的产生与 p33 、 p13 、 p18 基因之间表达的平衡有关。虽然长久以来 CTV 被认为只发生在韧皮部中,但近年来在部分茎陷点症状严重的成熟木质部中也检测出了 CTV 。随后 Sun 等 (2019 , 2021 )证实,除韧皮部相关细胞外, CTV 侵染的成熟木质部管状细胞和木质部薄壁细胞(射线细胞)也是诱发茎陷点症状的重要因素。通过对野生型CTV 和缺失体 CTV : Δp33 分别侵染敏感寄主 Citrusmacrophylla (大翼来檬)后茎陷点症状的形成过程进行观察发现,在侵染早期,CTV 依次侵入原韧皮部和韧皮部,随后 CTV 侵入并定殖于木质部,扰乱木质部细胞的分化,导致胶质物出现、细胞变形。随着形成层细胞的分裂和 CTV 的径向扩散,进一步导致锥形畸形扩大,最终产生茎陷点症状 。最新研究还显示,随着茎陷点症状的不断加重,胼胝质和韧皮部蛋白水平逐渐升高,β-1 , 3- 葡聚糖酶基因表达下降,表明茎陷点症状的发展与韧皮部闭塞的增加程度有关 。

9 蚜传机理

褐色桔蚜是 CTV 最重要的传播媒介,其在 CTV 病株上取食几秒至 30min 即可获毒,并在 24~48h 内保持传毒能力 。随着取食时间的延长,褐色桔蚜的传毒能力逐渐增强,取食24h 时,其传毒能力达到最大值。此外,褐色桔蚜传播CTV 的能力还受毒源植株和受毒植株种类、环境条件、CTV 毒株基因型以及蚜虫中 CTV 含量等多个因素的影响 。

国内外对蚜虫传播 CTV 的分子机理开展了多年研究, Satyanarayana 等 (2004 )通过比对其他病毒中已知蚜传相关蛋白后推测, CTV 编码的 p65 、p61 和 CP 等蛋白可能参与了蚜传。 Herron 等 (2006 )发现使用 CTVp20 抗体饲喂褐色桔蚜可提高其传播 CTV 毒株T66aH-1 的效率,由此认为 p20 蛋白与蚜传有关。但周彦等 (2007 )通过比对多个不同传毒能力的中国 CTV 毒株后发现,褐色桔蚜对 CTV 的传播能力与 p20 基因间似乎并不存在明显的关联,并且属于 CP / Hinf Ⅰ RFLP 第 3 组群的 CTV 毒株的传毒能力较强,由此推测 CP 基因可能在蚜传中发挥了功能。近年来,通过研究长线型病毒科中与 CTV 关系紧密的甜菜黄化病毒(beetyellowsvirus , BYV )、莴苣侵染性黄化病毒( lettuceinfectiousyellows , LiYV )等的虫传机理时发现,病毒编码的 CPm 在虫传过程中起着重要作用 ,并且鉴于CTV CPm基因的序列与其蚜传能力存在一定相关性,由此推测 CPm 可能也参与 了 CTV 的 蚜传过程 。

虽然对控制 CTV 蚜传能力的相关基因提出了多种猜测,但由于 CTV 基因组较大,不易获得全长克隆,因此难以构建重组病毒或缺失体来筛选、鉴定蚜传相关基因。直到 20 世纪末,Satyanarayana 等 (1999 )才首次以 T36 毒株为模板构建了 CTV 全长侵染性克隆。但是该侵染性克隆只有在本生烟原生质体中连续转代 4~6 次后才能侵染柑桔,且成功率不足1% 。为解决这一难题,Gowda 等 (2005 )将 CTV 的全序列置于农杆菌双元表达载体中35S 启动子的下游,采用农杆菌接种本生烟后,再提取病毒接种柑桔的方法,极大地提高了CTV 全长侵染性克隆感染柑桔的能力。在此基础上, Harper 等(2016 )和 Shilts 等(2020 )通过构建重组 CTV 发现,高蚜传能力 CTV 毒株 FS577 / T68-1 的 p65 、 p61 和 p33 可以显著提高 CTVT36 毒株的蚜传能力。免疫荧光标记进一步显示, CTV 通过 CPm 特异性结合于褐色桔蚜前肠(食窦和口针)表面的糖基,蛋白酶处理后也不影响 CTV 粒子在褐色桔蚜中的积累,但 p61 / p65 与 CPm 的互作会降低 CTV 粒子在蚜虫前肠的结合能力 。

10 防治方法

使用枳、枳橙、红桔、酸桔等抗耐病砧木是防治速衰型衰退病最有效的方法 。交叉保护技术能有效预防茎陷点型衰退病的发生,该技术在巴西、澳大利亚、秘鲁、南非等国被广泛用于防控甜橙和葡萄柚上的茎陷点型衰退病 。但是在使用传统方法筛选有保护作用的弱毒株时,不仅耗时,且难度大 。由于只有在相同基因型的CTV 毒株之间才会发生交叉保护现象,因此通过多重分子标记或深度测序技术,明确当地强毒株的组成和基因型,针对性选择相应的弱毒株,可提高交叉保护的成功率 。此外,混合使用不同基因型的CTV 弱毒株可进一步提高交叉保护的防治效果 。

11 展望

作为一种世界范围内的重要柑桔病毒,CTV 仍时刻威胁着世界柑桔产业的发展。大陆近年来多地暴发的茎陷点型衰退病多与苗木带病有关,因此苗木安全仍是保障柑桔产业健康、持续发展的基石。目前国内外对 CTV 的研究主要集中于流行区域监测、新株系鉴定、病毒基因功能验证、病毒 - 寄主 - 蚜虫互作、保护株筛选及应用,研究也已较为深入,但对柑桔抗耐病机制相关研究仍不足。今后随着柑桔抗耐病/敏感基因的挖掘鉴定,以及 CRISPR-Cas9 等基因编辑技术的发展、成熟,将有助于创制抗柑桔衰退病新品种,从而为柑桔产业的健康持续发展提供重要保障。