大家好，今天推送的文章是2023年12月发表在Bioresource Technology上的“
Novel cytochrome P450s for various hydroxylation of steroids from
filamentous fungi”，通讯作者为西南大学龙梦飞老师和江南大学廖国建教授。
羟基化甾体是一种具有多种生物活性的增值产物，但在真菌中很少被充分表征。作者通过转录组和生物信息学分析，介绍了一种丝状真菌P450酶的快速鉴定策略，在酿酒酵母和米曲霉中鉴定出5种在甾体6β、7α、7β、11α和15α羟基化位点上独特的P450酶(CYP68J5、CYP68L10、CYP68J3、CYP68N1和CYP68N3)，并通过分子自对接和分子动力学模拟来解释CYP68J5(11α和7α双功能羟化酶)和CYP68N1(11α羟化酶)之间的羟基化偏好机制。此外，作者通过将CYP68N1与细胞色素P450还原酶(CPR)、细胞色素b5(Cytb5)和ABC转运蛋白一起构建到工程酿酒酵母中，显著提高了(11α-OH-4AD)的产量，达到0.845 g⋅L-1，比原菌株提高了14倍。作者的研究为鉴定和实现新型细胞色素P450酶提供了一种全面的方法，为甾体产品的可持续生产铺平了道路。
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对甾体具有多种羟基化活性的丝状真菌
作者首先在实验室中对镰刀菌(F3-4268、F3-4488和F3-6793)、白僵菌球孢菌ARSEF2860和ARSEFrobertsiiARSEF23进行了对甾体药物基本前体4AD的羟基化活性测定。4AD与F3-4268孵育48h后，出现两个主要的羟基化产物，通过NMR谱鉴定为7α-OH-4AD和和11α-OH-4AD。F3-4488对4AD具有15α和6β羟基化活性，产生15α-OH-4AD和6β-oh-4AD。而菌株F3-6793对底物4AD的特异性较差。因此，使用另一种甾体药物基本前体DHEA取代4AD，鉴定出两个羟基化产物7α-oh-DHEA和7β-oh-DHEA。白僵菌球孢菌ARSEF23与4AD孵育时，鉴定出11α-oh-4AD和少量的11α，6β-diOH-4AD。而11α-OH-4AD似乎是白僵菌ARSEF2860的主要产物。
图1.不同丝状真菌对类固醇的生物转化
通过酿酒酵母或米曲霉菌表征候选羟化酶
甾体羟化酶主要由底物诱导，作者通过对有底物和无底物的样本进行转录组测序，以挖掘候选基因，通过转录组分析，确定了F3-4268、F3-6793和球孢白僵菌ARSEF2860的羟化酶。在F3-4268的43个上调基因中，只有一个CYP基因(4268CYP-1)，上调了约3倍。作者以已报道的c11α-羟化酶(CYP68J5为探针，利用LocalBLAST挖掘F3-4268的同源酶。通过序列比对，选择同源性排名最高的4268CYP-1、4268cyp2、4268CYP-3和4268cyp44个序列作为细胞色素P450候选基因。作者通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)量化它们诱导和非诱导条件下的表达水平。结果显示，4268CYP-1和4268CYP-3基因均上调。因此，4268CYP-1可能是菌株F3-4268中负责甾体羟基化的基因。菌株F3-6793中1017个基因出现相对上调，其中15个为细胞色素P450基因。CYP基因6793CYP-1(Cluster-371.5869)是P450基因中表达上调最显著的，诱导后表达量增加了10倍，因此筛选出来用于未来的分析(图2C)。
球孢白僵菌ARSEF2860上调基因中有383个CYP基因。4AD诱导后，CYP68N1基因(基因库ID:19886090)的转录丰度增加了11.32倍，是CYP基因中上调幅度最大的基因(图2D)，其次是CYP561D2P基因，上调幅度为7.34倍。这两个CYP基因都被认为是球孢白僵菌ARSEF2860的候选甾体羟化酶。对于F3-4488的羟化酶，C15α羟化产物略高于C6β羟化产物，说明C15羟化酶可能是初始羟化过程。作者以C15α-hy-羟基化酶(P450pra)为参考基因，通过LocalBLAST挖掘菌株F3-4488的同源酶，选取同源性排名最高的4488CYP-1、4488CYP-2、4488CYP-3、4488CYP-44个序列作为CYP候选基因，量化诱导和非诱导条件下的表达水平。4488CYP-1基因被发现上调(图2E)，因此被选为候选羟化酶用于分析。作者进一步通过构建系统发育树(图2F)以挖掘M.robertsiiARSEF23中的甾体羟化酶。其中CYP68N3与球孢单胞菌ARSEF2860的CYP68N1和4268CYP-1的同源性最高，分别为43.95%和38.93%。因此，CYP68N3被认为是M.robertsiiARSEF23中负责类固醇羟基化的候选P450酶。
图2.通过转录组测序和生物信息学分析挖掘CYP基因
通过酿酒酵母或米曲霉菌表征候选羟化酶
作者将候选基因4268CYP-1和4268CYP-3通过酿酒酵母异源表达，发现4268CYP-1产物与原始菌株(F3-4268)相同，这表明4268CYP-1(国际CYP命名委员会命名为CYP68J5)是负责F3-4268菌株催化过程的羟化酶。结果与上述假设一致，证明了转录组测序和LocalBLAST挖掘甾体羟化酶的可行性。作者将6793CYP-1基因通过酵母进行异源表达，以DHEA为底物验证其羟基化活性，却未检测到预期产物。作者猜测酿酒酵母BY4741ayr1Δ不是表达6793CYP-1基因的合适宿主。因此，设计了a.moryzaeNSAR1的异源表达系统来验证6793CYP-1的功能。在DHEA(0.1g⋅L-1)作用24h后，携带6793CYP-1的A.oryzaeNSAR1中出现了7α-OH-DHEA和7β-oh-DHEA，表明6793CYP-1(命名为CYP68L10)确实是F3-6793中对DHEA具有7α和7β羟基化活性的羟化酶。以4AD为底物，通过酿酒酵母BY4741ayr1Δ表达系统验证上调最多的基因CYP68N1和CYP561D2P的羟基化能力。与标准对照比较，c11α羟化酶的调控水平最高的基因为CYP68N1。而在菌株F3-4488中，4488CYP-1基因虽然在酿酒酵母BY4741ayr1Δ中成功表达，但4488CYP-1的效率相当低。因此作者使用了a.oryzaeNSAR1表达系统进行表达。然后将所得菌株与底物4AD一起供给以确认其羟基化能力。正如预期的那样，出现了两个目标羟基化产物，并且底物4AD也在24h内完全转化，这表明P450酶4488CYP-1(命名为CYP68J3)在A.oryzaeNSAR1中工作良好。此外，还将候选基因CYP68N3引入酿酒酵母BY4741ayr1Δ中，验证其羟基化功能。添加4AD后生成产物11α-oh-4AD和6β，11α-diOH-4AD。综上所述，共鉴定出5种新型甾体羟化酶，其中4种均为双功能酶，而CYP68N1具有较高的c11α羟化特异性。在鉴定菌株F3-6793中推定的羟化酶时，最高上调的CYP基因CYP68L10被证明无法在酿酒酵母中发挥其羟化功能。然而，CYP68L10被证实能够在米草霉中将DHEA转化为7α-OH-DHEA和7β-OH-DHEA。这些结果提示，在鉴定P450羟化类固醇酶时，可以将表达系统替换作为主要考虑因素。
CYP68J5和CYP68N1催化甾体羟基化的机理研究
为了探究CYP68J5和CYP68N1在C11和C7位置羟基化4AD的机制，作者分别利用AutoDock将这两种酶与血红素和4AD进行分子对接，发现CYP68J5中与4AD结合的残基具有更大的保守性，底物混杂性更强。在CYP68J5中，85W、298L、299V、302H、303T和480I与底物形成疏水相互作用，其中50%(302H、303T和480I)是保守的，而在CYP68N1中，只有304T是保守的，比例不到10%。此外，211S和219R在CYP68J5中与4AD存在额外的氢键。因此，4AD中B-C环的近似平面与血红素平面更加平行，而CYP68N1中4AD的B-C环更垂直于血红素平面。因此，CYP68J5中Fe原子与C11或C7之间的距离很近(5.7Å和5.9Å)，这可能是CYP68J5在4AD的C11和C7位置上都具有羟基化能力的原因。而在CYP68N1中，Fe与C11之间的距离4.9Å，只有11α-羟基化产物。
为了进一步研究羟基化偏好的机制，作者用Gromacs对CYP68J5和CYP68N1配合物进行了100ns的分子动力学模拟，在40ns后这两个系统达到稳定(图3C)。有趣的是，这两种酶之间有38.41%的同源性，但它们除了140-150、180-190、360-370、420-430和460-470的主要区域外表现出相似的残留波动。这些主要区域可能会对特定羟基化的底物构象产生影响。为了验证这一点，作者分别测量了Fe原子到C11和C7的距离(图3E)。在CYP68N1中，Fe与C11之间的平均距离为5.2Å，明显短于Fe与C7之间的距离。然而，在CYP68J5的前30ns内，Fe-C7之间的距离小于Fe-C11之间的距离。但是，在随后的过程中，Fe-C7和Fe-C11之间的距离在某些点上变得相等，这表明从空间距离的角度来看，CYP68J5可以羟基化11和7两个位置。在CYP68J5中，甾醇的B-C环接近与血红素平行排列，促进了C-H在多个位置的活化，并有助于产生多种羟基化产物。相反，在具有特定位置羟基化明显偏好的CYP68N1中，4AD的B-C环由于与靠近C11侧的残基的相互作用增加而发生了取向偏差。需要进一步的酶工程方法来阐明导致这些羟基化位置改变的特定氨基酸残基变化。
图3.4AD羟基化过程中CYP68N1/CYP68J5的分子对接和MD模拟
工程酿酒酵母11α-OH-4AD的生物合成
在五种P450酶中，作者选择CYP68N1用于构建微生物细胞工厂，以促进其单一产物(11α-OH-4AD)的生物合成。11α-OH-4AD是一种重要的药物中间体，用于生产利尿剂依普利酮，依普利酮是第一个被批准用于治疗急性心肌梗死后高血压和左心室功能障碍的选择性醛固酮受体拮抗剂。作者发现只携带CYP68N1的酿酒葡萄球菌Z-1仅显示出低水平的11α-OH-4AD产量，约为0.059g⋅L-1(表1)。
为了提高11α-OH-4AD的产量，作者进一步引入电子传递链元件还原酶、ABC转运蛋白和相关融合蛋白。通过BLASTp分析，在球孢白僵菌ARSEF2860中鉴定出了新的pr-1、CPR-2和Cytb5。CPR-2与兰花Absidia报道的CPR同源性分别为37.98%和39.70%，Cytb5与兰花Absidia报道的Cytb5同源性分别为56.96%。结果发现，CPRs和Cytb5可以通过有效的电子转移促进CYP68N1活性的增强。融合蛋白最近被归类为一类独特的新型生物分子，具有多种功能，包括增强蛋白质折叠和稳定性，促进蛋白质表达和增强内在生物活性。作者将CYP68N1与CPRs的融合表达进一步研究，发现CYP68N1和CPR-1/CPR-2的融合均促进了11α-OH-4AD的生物合成。之后，作者分别从表达元件的组装顺序、ABC转运蛋白和融合link长度方面进一步探索了最佳融合条件，最终，使用Z-11菌株在以1g/L-1饲喂4AD的情况下，在72h内获得了0.845g⋅L-1的11α-OH-4AD产量(图4B)，是初始菌株Z-1的14倍以上，是迄今为止酵母中11α-OH-4AD生物合成性能最高的菌株之一。
图4 改造CYP68N1羟化酶，提高11α-OH-4AD的产量
总结：
这项研究鉴定出5种新的P450酶，今后还需从真菌中鉴定出更多的P450酶，以丰富P450酶库，用于高价值天然产物的合成。(ii)4AD羟基化位置偏向(11α和7α)的机制也需要更多的实验证据而不是计算机辅助分析。(iii)合成生物学的新型使能技术，如模块化代谢工程，重构代谢网络和设计底物通道系统，以提高P450酶的催化效率，可以进一步用于类固醇类天然产物的高效生物合成。