大家好，今天为大家带来的是2024年4月24日发表在J Agric Food Chem.上的“Development of a Universal One-Step Purification and Activation Method to Engineer Protein-Glutaminase through Rational Design”，通讯作者是北京化工大学生命科学与技术学院的张桂敏教授。
细胞毒性酶通常以含有前结构域的酶原形式存在，以使其保持非活性状态。蛋白-谷氨酰胺酶（PG）是一种含有pro-PG序列和成熟PG（mPG）的酶，可以增强食品蛋白质的各种功能特性。然而，较差的活性和稳定性限制了其应用，而繁琐的纯化和活化步骤限制了其高通量工程。在此，作者通过结构分析，用HRV3C蛋白酶识别序列替换pro-PG序列和mPG序列之间的连接序列，然后将其与HRV3C蛋白酶在大肠杆菌中共表达，以开发一种高效的PG一步纯化和活化方法。然后，作者使用这种方法获得了通过计算机辅助方法和有益点突变相结合设计的几个突变体。最佳变异株D1的比活性（131.6 U/mg）是野生型的4.14倍，t1/2和 T5010分别增加了13分钟和7°C。D1可有效提高小麦蛋白的溶解度和乳化度，是野生型的两倍以上。作者还讨论了 D1 性能改善的机制。
- 1. PG一步纯化活化方法
前人曾在pro-PG和mPG之间插入HRV3C-p-s和GS接头，希望通过这种方式简化PG的纯化方式，然而，作者发现这种方式的蛋白质表达水平非常低，他们推测，这是由于添加的外源氨基酸会导致pro-PG与mPG之间的序列长度增加，使前者无法完全阻断PG发挥功能，进而产生细胞毒性，使蛋白表达水平降低。
因此，作者对1）插入HRV3C-p-s和GS接头2）仅插入HRV3C-p-s 3）PG酶原始结构建模分析比较。结果表明，HRV3C-p-s和GS接头的插入导致形成一个突出的环（图1a），而HRV3C-p-s的插入导致两个突出螺旋的形成（图1b）。在结构分析的基础上，作者设计了一种名为PGsub的蛋白质，将pro-PG和mPG之间的序列VKGQTNKL替换为HRV3C蛋白酶（LEVLFQGP）的识别序列，而不改变原始PG长度。如图1c所示，PGsub和PG具有相似的结构，并且两种结构叠加得很好。作者在大肠杆菌中表达它，并通过HRV3C-p在体外激活PGsub，然后测量酶活性。与WT（图2）相比，PGsub的产量没有显著变化。此外，其比活性（31.8 U/mg）高于WT（27 U/mg）。
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为简化实验流程，作者在大肠杆菌中构建了一个共表达系统，包括通过 IPTG 诱导表达 PGsub 的载体pET28a 和通过阿拉伯糖诱导表达 HRV3C-p 的载体pEVOL（图 3d）。经过广泛的优化（图3e），作者发现同时补充0.1mM IPTG和0.2%阿拉伯糖并在18°C下诱导培养20小时显著增加了mPG的量。该共表达系统可通过Ni-NTA亲和层析一步纯化和激活mPG，显著提高了获得纯化PG变体的效率。
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- 2. 通过理性设计增强 PGsub活性
通过基于能量的策略，FireProt产生了五种变体，包括G63W（X1）、S136M（X2）、S144P（X3）、S261F（X4）和S289M（X5），并且通过基于进化的策略，推荐了另外九种变体，包括L65I（X6）、G87A（X7）、T102S（X8）、A193S（X9）、Y204F（X10）、T211 V（X11）、N262G（X12）、Y264L（X13）和I271 V（X14）（图4).
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比活度（图5a）和热稳定性（图5b）分析表明，大多数变体表现出良好的比活度和热稳定性。值得注意的是，T211 V（X11）的比活性与WT相比显著提高了2.61倍，在37 °C下预处理1 h后仍保持了71%的残余活性。相比之下，WT在相同条件下仅保留了60%的残余活性。同样，I271 V （X14） 的比活性大幅增加 1.89 倍，预处理后保留了 67% 的残余活性。此外，Y204F（X10）在37°C下预处理1小时后，比活性也增加了1.84倍，并保持了66%的残余活性。重要的是，这些突变体的表达率没有显著降低（图6），证实了它们是有效的突变位点。
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3.通过多种突变改善酶特性
为了进一步提高活性和热稳定性，作者构建了多个双点突变体。基于单位点变体对提高活性和热稳定性的贡献，作者将最佳变体 T211 V 与其他更好的变体相结合，获得了一系列双位点变体 T211 V/I271 V （D1）、T211 V/Y204F （D2）、T211 V/A193S （D3）、T211 V/L65I （D4）、T211 V/T102S （D5） 和 T211 V/Y264L （D6）。所有变体都可以常规表达（图6）。令人鼓舞的是，如图7a所示，D1的比活性增加到131.6 U/mg，与WT相比显著增加4.14倍。此外，如图7b所示，在37 °C预孵育0.5和1 h后，D1的残余活性分别保持在99%和87%，而WT的残余活性仅保持在93%和60%。对于其他变异株，活性低于单位点变异株T211。
图7
3.检查检查变体 D1 的酶特性
如图8a所示，WT和D1在35至55 °C之间都具有很高的活性，并且在50 °C时都表现出最佳性能。值得注意的是，在15至65 °C的温度范围内，D1的酶活性明显高于WT。具体而言，与WT相比，D1在35 °C下的活性增加了4倍，在55 °C下的活性增加了4.1倍。此外，我们通过在37和55°C下对它们进行不同持续时间的预处理来检查热稳定性。如图4b所示，D1在37°C下预处理1小时后仍保留87%的残余活性，而WT在相同条件下仅保留60%。同样，在55°C下预处理1小时后，D1保留73%的残余活性，而WT在相同条件下仅保留50%。
图8
同时，作者还分析了半衰期和半失活温度并发现D1半衰期增加13 min，D1半失活增加7°C（图9）。
图9
作者还确定了 WT 和 D1 的最佳 pH 值和稳定性。WT 和 D1 都表现出相对较宽的 pH值范围，其峰值活性出现在中性 pH 值范围内，主要在 pH = 6.5 时。然而，在酸性或碱性条件下，它们的活性显著降低。值得注意的是，D1在5-9的pH范围内显示出很强的活性（图8c）。对于pH值的稳定性，暴露于不同pH值36 h后，WT和D1的酶活性在中性pH范围内没有显著变化。值得注意的是，在pH=6至8的pH范围内，D1的酶活性在36 h后保持在95%以上，而WT只能保持83%的残留活性。具体而言，D1在pH = 4.5和8.5时分别保留了66%和83%的残余活性36小时，而WT在相同条件下表现出50%和53%的残留活性（图8d）。
WT和D1的动力学参数如图10所示。相比之下，D1 和 WT 的 K m相似（1.47 与 1.51 mM），但 kcat增加了 3.30 倍（1787 min−1vs 543min−1） 和 kcat/Km增加了 3.38 倍（214 vs 359 mM−1min−1).因此，D1具有更高的催化效率，突出了转化效率的提高。
图10
- 4. 提高D1酶活性的机理分析
经过结构模拟，作者发现WT和D1的催化三联体几乎重叠（图11），在活性位点附近没有发现显著差异。因此，作者推测 WT 和 D1 在底物结合通道中可能不同。事实上，先前的研究还表明，PG的催化残基C177（对应于作者结构中的C156）是底物结合的关键残基，并且该残基位于表面的浅裂隙中，这里定义为底物结合通道。因此，作者使用 YASARA 确定了 D1 和 WT 的平均构象，并使用 CAVER 计算了底物结合通道的体积（图 12a、b）。图12a显示WT的底物结合通道体积（绘制为蓝色球体）为1310±3 Å3，而 D1 的体积（绘制为橙色球体）为 1492 ± 4 Å3 (图12b）。D1的底物结合通道的大小略有增加，约为WT的1.14倍，这可能允许更多的底物（146 Å3）进入有源口袋，从而增加D1的活性。此外，底物结合通道的这种轻微增加并没有破坏整体蛋白质结构的稳定性，因为松弛的结构可能会降低蛋白质的稳定性。值得注意的是，C156可以直接与D1中的底物结合通道相互作用，而WT则不能。
图11
图12
此外，作者还分析了两种酶的RMSF值。RMSF反映了每个原子的结构变化，RMSF值越高，结构越灵活。事实上，D1在Y266和V271之间具有更高的RMSF值（图13c）。从结构上讲，Y266-L270是环路区域，而V271-S281形成α螺旋，V271位于这两个区域之间的界面。此外，当WT的I271突变为V时，侧链变小，更有利于V271附近环路区域的振荡。值得注意的是，环区（Y266–L270）位于活性口袋的正上方，D1中的Y266仅与位于pro-PG和mPG之间的环区中的E107形成较长（2.8 Å）的氢键，而WT中的Y266与E107（2.3 Å）和E109（2.4 Å）形成两个较短的氢键（图13d）。当与该环区的相互作用减少时，pro-PG可以更好地与mPG分离，从而降低对mPG活性的抑制，从而提高催化活性。应该注意的是，尽管pro-PG和mPG被HRV3C-p切割，但这两个结构域仍然通过蛋白质-蛋白质相互作用相互结合。
图13
5.D1稳定性提高机制分析
为了更深入地了解 D1 增强的热稳定性，作者分别在 37 和 55 °C 下对 WT 和 D1 进行了连续 50 ns 的分子动力学模拟。如图14a所示，在37和55 °C下，D1的RMSD值均低于WT值。随着温度的升高，D1的RMSD值变化小于WT的RMSD值。当比较37 °C时的平均RMSD值时，D1（1.401）低于WT（1.532）;同样，在55°C时，D1（1.541）也低于WT（1.751）。综上所述，D1的RMSD显著低于WT，表明D1具有更好的热稳定性。
图14
作者还分析了T211 V和I271 V两个突变位点对局部结构的影响。作者发现，当位置211的苏氨酸被缬氨酸取代时，位置211的β片向上弯曲，导致β片与附近残基之间的相互作用更强（图15b）。具体而言，对于 WT，I215与 V226 形成两个氢键（2.8 和 3.1 Å），与 W231 形成两个π-π 相互作用（3.8 和 4.9 Å），与 A199 形成一个烷基π相互作用 （3.4 Å）。对于 D1，I215 与 V226 （1.8 Å， 2.2 Å） 形成两个氢键，与 W231 形成两个 π-π 相互作用 （3.4 Å， 4.5 Å），与 A199形成一个烷基-π相互作用 （2.7 Å），与 L201 形成一个额外的烷基-π相互作用 （3.7 Å）。这些键在 D1 中的距离显然比在 WT 中短。此外，D1 中的 I215和 L201 之间还形成了额外的烷基π相互作用，导致 D1 的结构更紧密、稳定性更高。
I271 V突变导致残基侧链减少，从而减少空间位阻，这不仅导致附近环区具有更大的灵活性，而且在D1的C末端形成小的α螺旋结构（S295-C297），而在WT的相应位置形成环（图15c）。此外，这种新形成的小α螺旋（S295-C297）具有三个额外的氢键和两个额外的烷基-π与周围氨基酸的相互作用。事实上，二级结构由无序到有序的变化以及附加力的形成显著增加了整体蛋白质结构的稳定性。
图15
- 6. PG处理后小麦蛋白特性分析
用WT和D1处理小麦蛋白后，作者测定了它们的溶解度并释放了氨浓度。通过对处理效果的目视观察，发现WT和D1处理后的小麦蛋白与对照（CK）有显著差异（图16a）。未经酶处理的小麦蛋白的溶解度和游离氨浓度几乎不随时间变化，而WT和D1处理的小麦蛋白随时间变化较大。用D1处理的小麦蛋白的溶解度约为WT的两倍（图16b），游离氨浓度约为WT的1.3倍（图16c）。此外，D1处理的小麦蛋白的EP和ES分别约为WT的2.78倍（图16d）和3.14倍（图16e）。
图16
作者还使用SEM分析了未经处理、WT处理和D1处理的小麦蛋白的表面形态。发现，未经处理的小麦蛋白显示出大而光滑的片状形态（图17a-c），WT处理的小麦蛋白显示出略微松散的块状形态（图17d-f），而D1处理的小麦蛋白显示出非常松散和粗糙的多孔形态（图17g-i）。作者推测D1可以更有效地将小麦蛋白中的谷氨酰胺脱氨为谷氨酸，导致表面氨基酸残基负电荷之间的静电排斥增强，并使小麦蛋白的一些疏水区暴露于水环境中，从而产生更松散的形式。
图17