大家好，今天推送的文章是2023年12月發表在Bioresource Technology上的“
Novel cytochrome P450s for various hydroxylation of steroids from
filamentous fungi”，通訊作者為西南大學龍夢飛老師和江南大學廖國建教授。
羟基化甾體是一種具有多種生物活性的增值産物，但在真菌中很少被充分表征。作者通過轉錄組和生物資訊學分析，介紹了一種絲狀真菌P450酶的快速鑒定政策，在釀酒酵母和米曲黴中鑒定出5種在甾體6β、7α、7β、11α和15α羟基化位點上獨特的P450酶(CYP68J5、CYP68L10、CYP68J3、CYP68N1和CYP68N3)，并通過分子自對接和分子動力學模拟來解釋CYP68J5(11α和7α雙功能羟化酶)和CYP68N1(11α羟化酶)之間的羟基化偏好機制。此外，作者通過将CYP68N1與細胞色素P450還原酶(CPR)、細胞色素b5(Cytb5)和ABC轉運蛋白一起建構到工程釀酒酵母中，顯著提高了(11α-OH-4AD)的産量，達到0.845 g⋅L-1，比原菌株提高了14倍。作者的研究為鑒定和實作新型細胞色素P450酶提供了一種全面的方法，為甾體産品的可持續生産鋪平了道路。
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對甾體具有多種羟基化活性的絲狀真菌
作者首先在實驗室中對鐮刀菌(F3-4268、F3-4488和F3-6793)、白僵菌球孢菌ARSEF2860和ARSEFrobertsiiARSEF23進行了對甾體藥物基本前體4AD的羟基化活性測定。4AD與F3-4268孵育48h後，出現兩個主要的羟基化産物，通過NMR譜鑒定為7α-OH-4AD和和11α-OH-4AD。F3-4488對4AD具有15α和6β羟基化活性，産生15α-OH-4AD和6β-oh-4AD。而菌株F3-6793對底物4AD的特異性較差。是以，使用另一種甾體藥物基本前體DHEA取代4AD，鑒定出兩個羟基化産物7α-oh-DHEA和7β-oh-DHEA。白僵菌球孢菌ARSEF23與4AD孵育時，鑒定出11α-oh-4AD和少量的11α，6β-diOH-4AD。而11α-OH-4AD似乎是白僵菌ARSEF2860的主要産物。
圖1.不同絲狀真菌對類固醇的生物轉化
通過釀酒酵母或米曲黴菌表征候選羟化酶
甾體羟化酶主要由底物誘導，作者通過對有底物和無底物的樣本進行轉錄組測序，以挖掘候選基因，通過轉錄組分析，确定了F3-4268、F3-6793和球孢白僵菌ARSEF2860的羟化酶。在F3-4268的43個上調基因中，隻有一個CYP基因(4268CYP-1)，上調了約3倍。作者以已報道的c11α-羟化酶(CYP68J5為探針，利用LocalBLAST挖掘F3-4268的同源酶。通過序列比對，選擇同源性排名最高的4268CYP-1、4268cyp2、4268CYP-3和4268cyp44個序列作為細胞色素P450候選基因。作者通過實時熒光定量PCR(qRT-PCR)量化它們誘導和非誘導條件下的表達水準。結果顯示，4268CYP-1和4268CYP-3基因均上調。是以，4268CYP-1可能是菌株F3-4268中負責甾體羟基化的基因。菌株F3-6793中1017個基因出現相對上調，其中15個為細胞色素P450基因。CYP基因6793CYP-1(Cluster-371.5869)是P450基因中表達上調最顯著的，誘導後表達量增加了10倍，是以篩選出來用于未來的分析(圖2C)。
球孢白僵菌ARSEF2860上調基因中有383個CYP基因。4AD誘導後，CYP68N1基因(基因庫ID:19886090)的轉錄豐度增加了11.32倍，是CYP基因中上調幅度最大的基因(圖2D)，其次是CYP561D2P基因，上調幅度為7.34倍。這兩個CYP基因都被認為是球孢白僵菌ARSEF2860的候選甾體羟化酶。對于F3-4488的羟化酶，C15α羟化産物略高于C6β羟化産物，說明C15羟化酶可能是初始羟化過程。作者以C15α-hy-羟基化酶(P450pra)為參考基因，通過LocalBLAST挖掘菌株F3-4488的同源酶，選取同源性排名最高的4488CYP-1、4488CYP-2、4488CYP-3、4488CYP-44個序列作為CYP候選基因，量化誘導和非誘導條件下的表達水準。4488CYP-1基因被發現上調(圖2E)，是以被選為候選羟化酶用于分析。作者進一步通過建構系統發育樹(圖2F)以挖掘M.robertsiiARSEF23中的甾體羟化酶。其中CYP68N3與球孢單胞菌ARSEF2860的CYP68N1和4268CYP-1的同源性最高，分别為43.95%和38.93%。是以，CYP68N3被認為是M.robertsiiARSEF23中負責類固醇羟基化的候選P450酶。
圖2.通過轉錄組測序和生物資訊學分析挖掘CYP基因
通過釀酒酵母或米曲黴菌表征候選羟化酶
作者将候選基因4268CYP-1和4268CYP-3通過釀酒酵母異源表達，發現4268CYP-1産物與原始菌株(F3-4268)相同，這表明4268CYP-1(國際CYP命名委員會命名為CYP68J5)是負責F3-4268菌株催化過程的羟化酶。結果與上述假設一緻，證明了轉錄組測序和LocalBLAST挖掘甾體羟化酶的可行性。作者将6793CYP-1基因通過酵母進行異源表達，以DHEA為底物驗證其羟基化活性，卻未檢測到預期産物。作者猜測釀酒酵母BY4741ayr1Δ不是表達6793CYP-1基因的合适宿主。是以，設計了a.moryzaeNSAR1的異源表達系統來驗證6793CYP-1的功能。在DHEA(0.1g⋅L-1)作用24h後，攜帶6793CYP-1的A.oryzaeNSAR1中出現了7α-OH-DHEA和7β-oh-DHEA，表明6793CYP-1(命名為CYP68L10)确實是F3-6793中對DHEA具有7α和7β羟基化活性的羟化酶。以4AD為底物，通過釀酒酵母BY4741ayr1Δ表達系統驗證上調最多的基因CYP68N1和CYP561D2P的羟基化能力。與标準對照比較，c11α羟化酶的調控水準最高的基因為CYP68N1。而在菌株F3-4488中，4488CYP-1基因雖然在釀酒酵母BY4741ayr1Δ中成功表達，但4488CYP-1的效率相當低。是以作者使用了a.oryzaeNSAR1表達系統進行表達。然後将所得菌株與底物4AD一起供給以确認其羟基化能力。正如預期的那樣，出現了兩個目标羟基化産物，并且底物4AD也在24h内完全轉化，這表明P450酶4488CYP-1(命名為CYP68J3)在A.oryzaeNSAR1中工作良好。此外，還将候選基因CYP68N3引入釀酒酵母BY4741ayr1Δ中，驗證其羟基化功能。添加4AD後生成産物11α-oh-4AD和6β，11α-diOH-4AD。綜上所述，共鑒定出5種新型甾體羟化酶，其中4種均為雙功能酶，而CYP68N1具有較高的c11α羟化特異性。在鑒定菌株F3-6793中推定的羟化酶時，最高上調的CYP基因CYP68L10被證明無法在釀酒酵母中發揮其羟化功能。然而，CYP68L10被證明能夠在米草黴中将DHEA轉化為7α-OH-DHEA和7β-OH-DHEA。這些結果提示，在鑒定P450羟化類固醇酶時，可以将表達系統替換作為主要考慮因素。
CYP68J5和CYP68N1催化甾體羟基化的機理研究
為了探究CYP68J5和CYP68N1在C11和C7位置羟基化4AD的機制，作者分别利用AutoDock将這兩種酶與血紅素和4AD進行分子對接，發現CYP68J5中與4AD結合的殘基具有更大的保守性，底物混雜性更強。在CYP68J5中，85W、298L、299V、302H、303T和480I與底物形成疏水互相作用，其中50%(302H、303T和480I)是保守的，而在CYP68N1中，隻有304T是保守的，比例不到10%。此外，211S和219R在CYP68J5中與4AD存在額外的氫鍵。是以，4AD中B-C環的近似平面與血紅素平面更加平行，而CYP68N1中4AD的B-C環更垂直于血紅素平面。是以，CYP68J5中Fe原子與C11或C7之間的距離很近(5.7Å和5.9Å)，這可能是CYP68J5在4AD的C11和C7位置上都具有羟基化能力的原因。而在CYP68N1中，Fe與C11之間的距離4.9Å，隻有11α-羟基化産物。
為了進一步研究羟基化偏好的機制，作者用Gromacs對CYP68J5和CYP68N1配合物進行了100ns的分子動力學模拟，在40ns後這兩個系統達到穩定(圖3C)。有趣的是，這兩種酶之間有38.41%的同源性，但它們除了140-150、180-190、360-370、420-430和460-470的主要區域外表現出相似的殘留波動。這些主要區域可能會對特定羟基化的底物構象産生影響。為了驗證這一點，作者分别測量了Fe原子到C11和C7的距離(圖3E)。在CYP68N1中，Fe與C11之間的平均距離為5.2Å，明顯短于Fe與C7之間的距離。然而，在CYP68J5的前30ns内，Fe-C7之間的距離小于Fe-C11之間的距離。但是，在随後的過程中，Fe-C7和Fe-C11之間的距離在某些點上變得相等，這表明從空間距離的角度來看，CYP68J5可以羟基化11和7兩個位置。在CYP68J5中，甾醇的B-C環接近與血紅素平行排列，促進了C-H在多個位置的活化，并有助于産生多種羟基化産物。相反，在具有特定位置羟基化明顯偏好的CYP68N1中，4AD的B-C環由于與靠近C11側的殘基的互相作用增加而發生了取向偏差。需要進一步的酶工程方法來闡明導緻這些羟基化位置改變的特定氨基酸殘基變化。
圖3.4AD羟基化過程中CYP68N1/CYP68J5的分子對接和MD模拟
工程釀酒酵母11α-OH-4AD的生物合成
在五種P450酶中，作者選擇CYP68N1用于建構微生物細胞工廠，以促進其單一産物(11α-OH-4AD)的生物合成。11α-OH-4AD是一種重要的藥物中間體，用于生産利尿劑依普利酮，依普利酮是第一個被準許用于治療急性心肌梗死後高血壓和左心室功能障礙的選擇性醛固酮受體拮抗劑。作者發現隻攜帶CYP68N1的釀酒葡萄球菌Z-1僅顯示出低水準的11α-OH-4AD産量，約為0.059g⋅L-1(表1)。
為了提高11α-OH-4AD的産量，作者進一步引入電子傳遞鍊元件還原酶、ABC轉運蛋白和相關融合蛋白。通過BLASTp分析，在球孢白僵菌ARSEF2860中鑒定出了新的pr-1、CPR-2和Cytb5。CPR-2與蘭花Absidia報道的CPR同源性分别為37.98%和39.70%，Cytb5與蘭花Absidia報道的Cytb5同源性分别為56.96%。結果發現，CPRs和Cytb5可以通過有效的電子轉移促進CYP68N1活性的增強。融合蛋白最近被歸類為一類獨特的新型生物分子，具有多種功能，包括增強蛋白質折疊和穩定性，促進蛋白質表達和增強内在生物活性。作者将CYP68N1與CPRs的融合表達進一步研究，發現CYP68N1和CPR-1/CPR-2的融合均促進了11α-OH-4AD的生物合成。之後，作者分别從表達元件的組裝順序、ABC轉運蛋白和融合link長度方面進一步探索了最佳融合條件，最終，使用Z-11菌株在以1g/L-1飼喂4AD的情況下，在72h内獲得了0.845g⋅L-1的11α-OH-4AD産量(圖4B)，是初始菌株Z-1的14倍以上，是迄今為止酵母中11α-OH-4AD生物合成性能最高的菌株之一。
圖4 改造CYP68N1羟化酶，提高11α-OH-4AD的産量
總結：
這項研究鑒定出5種新的P450酶，今後還需從真菌中鑒定出更多的P450酶，以豐富P450酶庫，用于高價值天然産物的合成。(ii)4AD羟基化位置偏向(11α和7α)的機制也需要更多的實驗證據而不是計算機輔助分析。(iii)合成生物學的新型使能技術，如子產品化代謝工程，重構代謝網絡和設計底物通道系統，以提高P450酶的催化效率，可以進一步用于類固醇類天然産物的高效生物合成。