大家好，今天推送的文章是2024年4月發表在JAFC上的“Computation-Guided Rational Design of Cysteine-Less Protein Variants in Engineered hCGL”，通訊作者為中國醫學科學院北京協和醫學院藥物生物技術研究所的金媛媛副研究員和楊兆勇研究員。
半胱氨酸因其較低的 S-H 鍵解離能和硫原子的顯著極化性，使其具有高度反應性和獨特的親核性。分子内二硫鍵賦予蛋白質結構穩定性，但分子之間半胱氨酸殘基非常接近而産生的額外分子間二硫鍵可能導緻蛋白質聚集和随後的沉澱。研究表明半胱氨酸突變去除二硫鍵可以大大提高蛋白質在體外的溶解度，并且還可以防止由于随機二硫鍵橋接而導緻的蛋白質聚集。本文中作者團隊為了增強工程化hCGL的制藥潛力，采用了一種非正常的方法，系統地重新設計了所有半胱氨酸殘基，獲得表現出高活性或增強穩定性的突變變體，同時辨識工程化 hCGL 中半胱氨酸殘基的關鍵作用并分析潛在的修飾位點。
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工程化 hCGL 中半胱氨酸殘基的再造鑒定
hCGL和工程化 hCGL E59T-E339V與L-Cys絡合物的晶體結構已被解析。作者團隊突變工程化 hCGL 中的所有半胱氨酸殘基，以探索它們對活性和穩定性的影響。工程化 hCGL 蛋白的每個單體單元内有 10 個半胱氨酸殘基，即 C70、C84、C109、C137、C172、C229、C252、C255、C307 和 C310（圖 1）。C70、C172、C252 和 C255 位于α螺旋中。C84 和 C109 位于β折疊内，深深嵌入蛋白質内部。位于 137、229、307 和 310 位的半胱氨酸殘基位于環區内，處于蛋白質表面。這 10 個未結合的半胱氨酸部分不會在單個單體結構内或不同亞基中建立二硫鍵（圖 1）。
作者團隊使用Rosetta和ABACUS的Cartesian_ddG子產品對工程化hCGL内的所有半胱氨酸殘基進行虛拟飽和誘變，目的是從折疊能量和統計能量的角度評估突變的影響。結果顯示，共有8個潛在的有益突變體（ΔΔG小于-1.5或B小于-3.0）：C84A、C109V、C137V、C172V、C229D、C255L、C307F和C310V。但這種合理的設計方法忽略了對hCGL半胱氨酸殘基的可能修飾，如S-硫化、S-亞硝化和多硫化。
圖 1
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突變體活性、熱穩定性的表征和酶促特性
作者團隊使用親和層析的方法純化了野生型和突變體，與野生型相比，單個位點的遊離半胱氨酸取代不影響蛋白質表達水準。在 37 ℃ 反應條件下，分别以l-Cys和CSSC為底物測定WT和突變體的比活性（圖2）。與WT相比，突變體C109V、C137V、C172V、C229D和C255L對兩種底物的活性均增加。其中突變體C109V對l-Cys和CSSC的活性分别比WT高1.9倍和1.8倍；其餘4個突變體C137V、C172V、C229D和C255L分别以l-Cys為底物時活性增加77%、64%、18%和27%，以CSSC為底物的活性分别增加47%、15%、55%和51%；突變體C84A和C310V表現出不同程度的活性降低；突變體C307F以l-Cys為底物的活性降低28%，以CSSC為底物的活性增加20%。位于蛋白質表面的 84 位的半胱氨酸突變為疏水性丙氨酸時，會導緻蛋白質不穩定，進而導緻 C84A 突變體的穩定性降低。當以l-Cys為底物時，C109S和C307F的活性低于WT。除此之外，補充材料提供了突變體中半胱氨酸取代改變蛋白質寡聚體形式的證據。
圖 2
如圖 3A 所示，作者團隊評估了突變酶的最佳反應溫度, 突變體C109V、C137V和C229D表現出與WT一緻的最佳反應溫度,相反突變體C84A、C172V、C255L、C307F和C310V的最佳反應溫度與WT相比顯著降低了5 ℃。但些突變體以較低的最佳反應溫度為特征，在55 ℃ 時表現出更高的殘留活性。值得注意的是，在所有突變體中，突變體C229D在80 °C時表現出最高的殘留活性。
為了研究酶的熱穩定性，作者團隊測量了野生型及其突變體的 Tm 值。如表 2 所示，兩個突變體表現出增強的 Tm 值，突變體 C229D 與 WT 相比升高了約 2 ℃，突變體C109V 提高了大于 8 ℃。此外突變體C109V和C229D在兩種底物下的催化活性均表現出不同程度的改善，将所有突變體在 60 ℃ 下孵育不同時間，随後确定其特定活性（圖3CD），突變體C229D在 60℃ 下孵育80分鐘後，保留了90%的初始活性，其比活性分别是以l-Cys和CSSC為底物的WT的 1.63 倍和 1.41 倍。大多數突變體表現出與WT相似的活性降低趨勢，但突變體C84A除外，該突變體在孵育60分鐘後表現出顯著的活性喪失。
表 2
圖 3
作者團隊在5.6–11.0的pH範圍内測定了突變體的最佳反應 pH 值。圖 3B 表明，當CSSC作為底物時，WT、C84A、C137V和C307V在 ph 7.5 的最佳反應pH值下表現出相同的最佳反應 pH 值，而C255L在稍高的pH值 8.2 下表現出其峰值活性。值得注意的是，C109V、C172V、C229D 和 C310V 在 pH 值 7.5–9.0 的寬範圍内表現出高活性。當使用l-Cys作為底物時，突變體的最佳反應pH值範圍為pH值8.2-9.0。
作者團隊為了進一步研究這些突變體的性質，使用l-Cys和CSSC作為底物進行了動力學實驗，結果表明 WT 及其突變體在底物選擇性方面更偏向于底物 CSSC，而不是底物 l-Cys。與底物L-Cys相比，WT及其突變體在催化CSSC方面都表現出更高的kcat值。以L-Cys為底物時，與WT相比，突變體C84A、C109V、C137V、C172V的KM值降低，突變體C307F變化不大，突變體C229D、C255L、C310V則有不同程度的升高。突變體C109V、C137V、C172V、C229D和C255L的kcat增加，其中C109V增加了近2倍。催化效率（kcat/KM）計算表明，突變體C109V和C137V的動力學效率提高了2倍以上，突變體C172V的動力學效率提高了約1.7倍。當CSSC用作底物時，除突變體C172V之外的所有突變體均表現出增加的KM值。突變體C109V的kcat表現出約1.8倍的增加，突變體C137V、C172V、C229D和C255L的kcat表現出約1.3倍的增加。突變體C109V和C137V的kcat/KM效率與WT大緻相同，而突變體C172V的動力學效率提高了1.3倍。
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基于蛋白質結構的互相作用分析
從以上結果可以看出，突變體C109V和C229D表現出驚人的性能。具有兩種底物的突變體 C109V 的比活性增加了約 2 倍，而 Tm 增加了約 8 ℃。盡管其對 CSSC 底物的催化效率與 WT 相當，但對 L-Cys 底物的催化效率增加了 2 倍以上。與WT相比，C229D突變體的Tm值提高了近 2 ℃，其對L-Cys和CSSC底物的催化活性分别提高了18%和55%。
作者團隊為了為了闡明這兩種突變體耐熱性的顯著改善的原因，使用 AlphaFold2 來建構上述突變體的結構（圖 4）。在 C109V 突變體中，第 109 位的殘基位于蛋白質内部并處于疏水環境中。半胱氨酸突變為疏水性缬氨酸顯著增強了與周圍氨基酸（V113、F121、I132、F134 和 W155）的疏水互相作用（圖 4AB）。為了驗證增強該區域的疏水性有利于提高活性，作者團隊在109位進行了飽和突變，如圖5所示，疏水性氨基酸亮氨酸、異亮氨酸和蛋氨酸的取代也顯著提高了活性。有趣的是，當109位突變為天冬氨酸、谷氨酸、組氨酸或賴氨酸時，突變體的活性急劇下降。在C229D突變體的情況下，用天冬氨酸取代229位的半胱氨酸不僅保留了預先存在的氫鍵，而且還在D229和E230以及S231之間引入了兩個額外的氫鍵（圖4CD）。由于産生了兩個補充氫鍵，突變體 C229D 的 Tm 相對于 WT 升高了 1.8 ℃。與所有其他突變體相比，該突變體在 60 ℃ 下表現出優異的熱穩定性。
圖 4
圖 5
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WT和突變體動态行為的計算分析
作者團隊為了闡明WT及其突變體C109V、C137V和C172V的不同活性和性質的結構基礎，在310 K下進行了幾次100 ns的分子動力學（MD）模拟（圖6A）。hCGL 和 MGL 都是 PLP 依賴性γ裂解酶的成員，并催化類似的反應。基于MGL的催化機理，确定了 Tyr114 (OTyr) 的 O 與 L-Cys （NCys）的 N 之間，PLP 的 C 與 NCys 之間的距離。反映了近攻擊構象（NAC）的穩定性，可用于評估催化活性。圖 6B 說明了在 MD 模拟期間觀察到的 WT、C109V、C137V 和 C172V 之間的兩個距離。C109V、C137V和C172V突變體的距離散射分布比WT更緊湊，與WT相比，C109V和C137V突變體的距離散射更集中在左下角，表明C109V和C137V突變體中的OTyr-NCys和CPLP-NCys 距離更小，是以它的NAC比WT更有利，推測 NAC 穩定性的提高是突變體 C109V、C137V 和 C172V 活性增強的根本原因。
圖 6
工程化的人胱硫醚-γ-裂解酶 (hCGL) 可以增強對半胱氨酸和胱氨酸的活性，揭示了潛在的強大抗惡性良性腫瘤活性。然而半胱氨酸殘基的存在有可能誘導寡聚或不正确的二硫鍵，這可能會降低藥物的生物利用度。作者團隊通過針對 hCGL 中半胱氨酸殘基的精心設計，使用 Rosetta 和 ABACUS 進行虛拟篩選，獲得了一組潛在的有益突變體。實驗測量表明，大多數突變體對底物 L-Cys 和 CSSC 的活性均有所增加。此外，突變體 C109V 和 C229D 的 Tm 值分别增加了 8.2 和 1.8 ℃。60℃孵育80分鐘後，突變體C229D仍保持較高的殘留活性。出乎意料的是，突變體 C109V 對兩種底物的活性均比野生型 (WT) 高約 2 倍，但在血漿中表現出令人失望的不穩定性，這表明計算設計仍需要進一步考慮。對它們的結構和分子動力學 (MD) 模拟的分析揭示了疏水互相作用、氫鍵和近攻擊構象 (NAC) 穩定性對活性和穩定性的影響。
文章資訊：
https://doi.org/10.1021/acs.jafc.3c06821