作者：刘雪兰1，董以雷1，Dalle Zotte2，伏春燕1，张亨1，石天虹1，李霞1，魏祥法1，刘瑞亭1，阎佩佩1*
单位：1.山东省农业科学院家禽研究所；2.University of Padua, Padua
简介：刘雪兰，女，山东成武人，研究员，从事饲料添加剂研发研究。*通信作者，助理研究员，从事饲料添加剂研发研究。
基金项目：山东省农业科学院国际科技合作专项 (CXGC2022F36）；山东省现代农业产业技术体系家禽创新 团队建设项目 (SDAIT-011-06);济南市“新高校 20 条”资助项目(202228037)。
来源：《安徽农业科学》2024年6期
引文格式：刘雪兰,董以雷,Dalle Zotte,等.黄粉虫抗菌肽的诱导·分离及其抗菌活性研究[J].安徽农业科学,2024,52(6):86-90,273.
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抗菌肽又叫抗微生物肽、肽抗生素，是生物机体在抵抗病原微生物侵染时产生的一类防御性小肽，通常为阳离子肽，含有10～50个氨基酸，分子量小，水溶性好，热稳定性强，无免疫原性。它作用于革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌、真菌、寄生虫等，可以快速查杀靶标。与传统抗生素相比，抗菌肽最大的优势在于对机体安全、无毒、无副作用，病原菌不易产生耐药性，是前景广阔的新一代替抗产品。
昆虫是现今陆生动物中最繁盛的一个类群，它在漫长的进化过程中形成了独特而高效的先天防御体系。当它受到损伤或被微生物感染后，短时间内迅速合成抗菌肽，并释放入血淋巴中作用于细菌、病毒、真菌等。黄粉虫是昆虫家族中的重要成员，其食性杂、繁殖力强、饲养简单、成本低，是很好的抗菌肽资源，引起科研工作者的广泛关注。
目的
探讨不同方法诱导对黄粉虫抗菌肽活性的影响，为黄粉虫抗菌肽的修饰改造、分子克隆、外源表达等奠定基础。
方法
选7龄、8龄、9龄的黄粉虫幼虫，以巴氏杆菌和沙门氏菌为诱导菌，采用微量注射法、针刺法诱导抗菌肽，对不同菌液浓度和不同方法诱导的不同龄期黄粉虫幼虫抗菌肽的抑菌效果进行研究。
结果
◆微量注射特定浓度菌液对黄粉虫抗菌肽的诱导
微量注射特定浓度巴氏杆菌对黄粉虫抗菌肽的诱导。表1结果表明：7、8、9龄黄粉虫幼虫注射特定浓度的巴氏杆菌后，诱导的抗菌肽抑菌活性显著大于未注射组 (P<0.05）；0.8pL组的7龄和8龄期黄粉虫抗菌肽的活性随作用时间的延长而显著增加(P<0.05）；1.2pL组7龄黄粉虫抗菌肽的活性以48h最高，显著高于24h的活性(P<0.05)，8龄和9龄黄粉虫的抗菌肽活性以24h的活性最高，显著高于48h的活性(P<0.05)；1.6pL组的7龄黄粉虫抗菌肽活性以72h最高，显著高于24和48h的活性(P<0.05），8龄和9龄黄粉虫24和48h的抗菌肽活性显著高于72h的活性(P<0.05），24和48h间的抗菌肽活性差异不显著(P>0.05）。由表1可以看出，用巴氏杆菌微量注射法诱导抗菌肽以注射0.8pL作用72h为宜。
注：表中同列不同小写字母表示在0.05水平差异显著。
微量注射特定浓度沙门氏菌对黄粉虫抗菌肽的诱导。表2结果显示：7龄、8 龄和9龄黄粉虫注射特定浓度的沙门氏菌后，诱导的抗菌肽抑菌活性显著大于未注射组(P<0.05）；0.8pL组7龄、8龄、9龄期黄粉虫的抗菌肽活性随作用时间的延长而显著增加(P<0.05）；1.2pL组7龄黄粉虫的抗菌肽的活性以72h最高，显著高于24h的活性(P<0.05），8龄和9龄黄粉虫的抗菌肽的活性以24h的活性最高，显著高于48h和72h的活性(P<0.05）；1.6pL组的7龄黄粉虫抗菌肽的活性以72h最高，显著高于24h的活性(P<0.05），8龄和9龄黄粉虫各时间段的抗菌肽活性差异不显著(P>0.05）。试验结果表明，以沙门氏菌微量注射法诱导抗菌肽以注射0.8pL作用72h为宜。
注：表中同列不同小写字母表示在0.05水平差异显著。
◆针刺不同次数对黄粉虫抗菌肽的诱导
针刺巴氏杆菌次数对不同龄期黄粉虫抗菌肽的诱导结果。图1结果显示：用同一浓度的巴氏杆菌针刺7龄黄粉虫，针刺次数对诱导的抗菌肽抑菌活性无显著影响(P>0.05）；针刺8龄黄粉虫，针刺次数对诱导的抗菌肽抑菌活性有显著影响，针刺2次和3次的抑菌活性显著大于针刺1次(P<0.05)；针刺9龄黄粉虫，针刺次数对诱导的抗菌肽的抑菌活性也有显著影响，针刺3次的抑菌活性显著大于针刺1次和2次(P<0.05）。
注：不同小写字母表示不同处理在0.05水平差异显著。
图 1 针刺巴氏杆菌诱导的抗菌肽抑菌圈直径
针刺沙门氏菌次数对不同龄期黄粉虫抗菌肽的诱导结果。图2结果表明：用同一浓度的沙门氏菌针刺7龄黄粉虫，针刺次数对诱导的抗菌肽抑菌活性有显著影响(P<0.05），针刺2次和3次获得的抗菌肽抑菌活性显著大于针刺1次(P<0.05)；针刺8龄黄粉虫，针刺次数对诱导的抗菌肽抑菌活性无显著影响(P>0.05）；针刺9龄黄粉虫，针刺次数对诱导的抗菌肽的抑菌活性也有显著影响，针刺1次和3次的抑菌活性显著大于针刺2次(P<0.05）。
注：不同小写字母表示不同处理在0.05水平差异显著。
图2 针刺沙门氏菌诱导的抗菌肽抑菌圈直径
◆微量注射不同浓度菌液对黄粉虫抗菌肽的诱导
微量注射不同浓度巴氏杆菌液对不同龄期黄粉虫抗菌肽的诱导。图3结果显示：用不同浓度的巴氏杆菌注射7龄黄粉虫诱导的抗菌肽活性以1/100组最高，显著高于1/10组和1/1000组(P<0.05)；对于8龄黄粉虫抗菌肽的诱导，1/10组和1/100组的活性显著大于1/1000组(P<0.05）；用9龄黄粉虫进行抗菌肽诱导，1/10组的活性显著大于1/100组和1/1000组(P<0.05），1/100组显著大于1/1000组(P<0.05）。
注：不同小写字母表示不同处理在0.05水平差异显著。
图3 微量注射不同浓度巴氏杆菌液诱导的抗菌肽抑菌圈直径
微量注射不同浓度沙门氏菌液对不同龄期黄粉虫抗菌肽的诱导。图4显示：用不同浓度的沙门氏菌注射7龄黄粉虫诱导的抗菌肽活性以1/100组最高，显著高于1/10组和1/100组(P<0.05）；对于8龄黄粉虫抗菌肽的诱导，各注射组的活性显著大于对照组(P<0.05），注射组间差异不显著(P>0.05）；用9龄黄粉虫进行抗菌肽诱导，1/10组的活性显著大于1/100组和1/1000组(P<0.05），1/100组和1/1000组间差异不显著(P>0.05）。
注：不同小写字母表示不同处理在0.05水平差异显著。
图4 微量注射不同浓度沙门氏菌诱导的抗菌肽抑菌圈直径
◆针刺不同浓度菌液对黄粉虫抗菌肽的诱导
针刺不同浓度巴氏杆菌液对不同龄期黄粉虫抗菌肽的诱导。图5显示：用不同浓度的巴氏杆菌液针刺7龄黄粉虫诱导的抗菌肽活性以1/100组最高，显著高于1/10组和1/1000组(P<0.05）；对于8龄黄粉虫抗菌肽的诱导，1/10组和1/100组抗菌肽的活性显著大于1/1000组和对照组(P<0.05）；用9龄黄粉虫进行抗菌肽诱时，1/100组的活性显著大于1/1000组和对照组(P<0.05），1/10组和1/100组之间差异不显著(P>0.05）。
注：不同小写字母表示不同处理在0.05水平差异显著。
图5 针刺不同浓度巴氏杆菌液诱导的抗菌肽抑菌圈直径
针刺不同浓度的沙门氏菌对不同龄期黄粉虫抗菌肽的诱导。图6结果显示：用不同浓度的沙门氏菌针刺7龄黄粉虫诱导的抗菌肽活性以1/100 组最高，显著高于1/10组、1/1000组和对照组 (P<0.05），1/10 组活性显著大于 1/1000组和对照组(P<0.05），1/1000 组和对照组间差异不显著(P>0.05）；对于8龄黄粉虫抗菌肽的诱导，1/10组和1/100组抗菌肽的活性显著大于1/1000组和对照组 (P<0.05），1/10组和1/100组之间、1/1000组和对照组之间差异不显著(P>0.05)；用9龄黄粉虫进行抗菌肽诱导时，1/100组的活性显著大于1/10组、1/1000组和对照组(P<0.05），1/10组和1/1000组之间差异不显著(P>0.05）但显著大于对照组(P<0.05）。
注：不同小写字母表示不同处理在0.05水平差异显著。
图6 针刺不同浓度的沙门氏菌诱导的抗菌肽抑菌圈直径
结论
黄粉虫抗菌肽的活性受黄粉虫龄期、诱导源微生物种类、菌液浓度、诱导方法的影响。该研究中，以8龄黄粉虫为试验动物，采用对数期沙门氏菌液稀释100倍进行微量注射法诱导，所获得的抗菌肽活性最好。
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- 采编：小白
- 排版：小同