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文|梦屿千辰
编辑|梦屿千辰
前言
过去科学研究的重点一直是花朵所表达的外部特征和奖励特征的功能价值。外部特征和花朵奖励的数量和质量都显示出显著的个体内变异水平。虽然奖励变异的一部分可能是由于传粉者先前的访问，但最近的证据表明，花朵特征中个体内变异的大部分是植物表型的固有特征。
因此，多花物种预计会表达一种复杂的特征，同时变异外部特征和奖励特征。尽管自然选择被预测有利于外部特征和奖励特征之间的关联，但很少有尝试实验证明特征组合的功能价值。
虽然许多研究探讨了种群内功能花部特征的多变量结构，但很少有人研究了个体内外部特征和奖励特征的协变关系的功能价值。因此，花朵信号和奖励之间的预期个体内关系仍然是一个未经测试的假设。
当传粉者连续访问同一植物的一系列花朵时，它会经历外部特征和奖励数量及质量的连续变化（从完全有奖励到欺骗性花朵的范围）。传粉者能够通过联想学习来获取关于信号-奖励相关性的信息，并能够将这些信息与之前的知识相结合，评估区域的质量。
只要植物在其信号的可靠性上存在差异，而传粉者基于这些信息做出觅食决策，自然选择就有望作用于信号和奖励之间的个体内相关性。最近的证据表明，传粉者介导的选择有利于高水平的信号准确性。
此外，理论模型表明，在重复的消费者-资源相互作用中，消费者在对信号做出反应后能够验证信号准确性（即信号验证）可以促进和维持可靠的信号传递。然而，目前尚无研究采用宏观进化方法评估信号-奖励个体内相关性的演化。
本研究结果支持了自然选择对信号和奖励特征之间关联的假设，以及传粉者在确定植物信号可靠性时的作用。此外，本研究为进一步探究个体内信号-奖励相关性的进化提供了基础，并为揭示植物传粉系统的适应性进化机制提供了新的视角。
二、研究物种
鼠尾草亚属是一组新热带植物的单系群，分布于从美国到智利和阿根廷的地区。它们的花朵具有复杂的双唇形或管状花部结构，且传粉综合征差异显著，其中大部分由蜜蜂传粉，约三分之一由蜂鸟传粉。
在墨西哥和阿根廷的自然种群中采样了18个鼠尾草物种，每个物种的主要传粉者类型是根据文献资料确定的，其中三个物种通过实地观察进行了确认。其中八个物种（S. atrocyanea、S. cinnabarina、S. elegans、S. fulgens、S. guaranitica、S. iodantha、S. mexicana和S. purpurea）主要由蜂鸟传粉，而其他物种由蜜蜂传粉。
鼠尾草物种中，墨西哥鼠尾草（Salvia mexicana）和紫鼠尾草（Salvia purpurea）具有很高的变异性，可以同时由蜜蜂和蜂鸟传粉。
然而，经过实地观察确认，蜂鸟是研究地点墨西哥鼠尾草的主要传粉者。至于紫鼠尾草，研究地点的花朵具有长的花冠管和相对较短且柔软的下唇，这些特征使得鸟类可以进入花蜜，排除了蜜蜂。
三、测量特征
每个物种采样了14至56个个体，每个个体采样了3至15朵花朵。对于花蜜测量，在中午将植物套袋，并在第二天在新开放的花朵上使用1或5微升的微型盖和温度补偿型手持折射仪（美国光学10431型）记录花蜜容量和糖浓度。
这些变量被用于计算花蜜中的糖含量。由于花朵在测量期间可能会积累花蜜，记录了每次测量的时间，并在随后的分析中使用糖含量与时间之间的回归残差。使用尼康D50数码相机为进行花蜜测量的相同花朵的侧面和正面拍摄照片，并使用参考尺度。
较小的花朵在较近的距离拍摄，以确保不同大小的花朵在照片中大致占据相同的相对面积。对于每张照片，使用参考尺度将面积测量值从像素转换为平方毫米，按照UTHSCSA Image Tool v. 3.00软件的说明进行操作。对于每朵花，测量了下唇的正面面积和花冠管的侧面面积。
四、信号-奖励相关性
当一个研究问题涉及评估两个或多个表型特征共同变化时，必须区分协方差的来源。由于对于个体内特征的协变性感兴趣，希望将个体内和个体间的协变性来源分离开来。个体内的协变性被认为是传粉者介导选择的目标，因为当传粉者访问同一植物的一系列花朵时，它们可以评估外部特征和奖励特征的变异性。
因此，传粉者可以验证植物信号的可靠性，并根据这些信息决定是否继续在给定植物中觅食。相反，个体间的协变性基于个体均值，因此它们是表征种群而不是个体表型的统计构建物。
要分离个体内和个体间的表型变异来源，通常需要使用混合模型来估计方差成分。按照Dingemanse＆Dochtermann的方法，从两个层次（即个体内和个体间）解开信号和奖励之间的相关性。
为此，使用具有双变量响应的贝叶斯广义线性混合模型（GLMM），使用R软件的MCMCglmm软件包。在这些模型中，奖励（花蜜糖含量）和信号（下唇面积或花冠管面积）被视为共同响应，并将个体身份引入作为随机效应。
从该模型中估计了两个方差-协方差矩阵的后验分布：
（1）个体随机效应的方差-协方差矩阵，其中对角线对应于奖励和信号一致个体效应的方差，非对角线值是它们之间的协方差；
（2）剩余方差-协方差矩阵，用于估计个体内的等效方差和协方差。利用后者矩阵，通过Pearson相关系数估计了信号和奖励之间的个体内相关性。
贝叶斯GLMM在130,000次迭代中运行，燃烧期为30,000次，稀疏间隔为100次，并使用平坦的gamma-inverse先验。对于每个相关性，获得了95%的最高后验密度（HPD）区间。个体内相关性的后验模态用于比较分析。每个物种拟合了两个模型：
一个模型中，联合响应为花蜜糖含量和下唇花部面积，另一个模型中，联合响应为花蜜糖含量和花冠管侧面面积。
评估了测量误差是否会影响相关性的估计，使用每个物种随机选择的10朵花作为较小的样本集。在这些花朵中，按照上述方法进行了三次面积测量。对于每个物种，获得了花蜜糖含量和下唇正面面积之间相关性的三个估计值，以及花蜜糖含量和花冠管面积之间相关性的三个估计值。
对于每个物种和形态测量，估计了这三个重复测量的标准偏差，代表了由于测量误差引起的变异性。在所有情况下，相关系数的标准偏差均低于0.072。
此外，由于估计的两个相关性之间的差异（即前端信号-奖励和侧面信号-奖励）对于测试的进化假设很重要，按照Nakagawa＆Schielzeth 的方法估计了这种差异的基于ANOVA的重复性（R）统计量。重复性为99.2%，表明与测量误差相关的相关差异方差的比例（1−R）非常低。
五、系统发育分析
为了测试一个特征是否是在漂移或一个或多个适应性极值的选择下进化，需要对分支长度进行系统发育估计。为此，从NCBI GenBank数据库中编译了70个分类单元的叶绿体DNA序列（包括psbA-trnH间隔区和包含trnL基因内含子和第二外显子以及trnL-trnF间隔区的片段），其中涉及鼠尾草亚属的53个物种和17个外群。
此外，为那些进行形态和花蜜特征测量的物种生成了序列，除了长穗鼠尾草（S. longispicata）。使用Qiagen多重PCR试剂盒（Qiagen）进行PCR，初始变性在94°C下进行15分钟，然后进行35个循环，每个循环包括94°C 30秒，57°C 1分钟和72°C 1分钟，最后延伸1分钟。
序列使用MUSCLE [31]进行比对，并通过SeaView 进行目测验证。插入/缺失突变（indels）根据Simmons＆Ochoterena 的简单方法手动编码。使用BEAST v. 1.7.5 软件包中的贝叶斯方法进行了系统发育估计，使用替代模型和对所有参数进行非信息性先验。
运行了三个独立的马尔科夫链蒙特卡罗（MCMC）50百万代。每1000代保存一棵树。每次运行的日志文件被导入到Tracer v. 1.4.1中，以检查有效样本量（ESS）和平稳性。这个测试表明，在5000万代内，分析已达到平稳状态，所有参数的ESS均超过200。
通过从每个样本中删除5000棵树，使用LogCombiner v. 1.5.3将单个运行的树文件合并。从树的后验分布中估计最大支持度树拓扑结构。将这个超度树的分支长度表示为每个位点的替代次数单位，并根据收集到形态和花蜜数据的18个分类单元进行修剪。修剪过程中移除了相应的内部支和外部支。
六、比较分析
在对信号-奖励相关性的演化进行建模之前，使用系统发育广义最小二乘法（PGLS）来描述传粉综合征在奖励（花蜜糖含量）、信号（下唇花部面积和花冠管面积）的平均值以及前端信号是否占优势（即下唇花部面积减去花冠管面积）方面的差异。
使用OUCH软件包进行模型建模，以描述个体内信号-奖励相关性的演化，其中包括BM过程（描述定量性状的中性演化）和不同的OU过程（描述不同的适应性假设对应于不同的选择机制）。该方法使用最大似然估计随机漂移的强度（σ，在BM模型中唯一的参数）、选择的强度（α）以及一个或多个适应性极值（θ）。
使用双变量模型允许所研究的两个个体内相关性的相关演化。测试了四种不同的模型，反映了对个体内信号-奖励相关性的假设性选择机制：在模型1中，个体内信号-奖励相关性通过纯漂移（BM）过程演化。
在模型2中，这些相关性通过单一选择方案演化，遵循具有全局进化适应性极值的OU过程（即所有物种都被吸引到表型空间中的一个单一适应峰，但同时随机漂移会导致围绕最优值的波动）。
在模型3中，个体内信号-奖励相关性在选择下演化为两个适应性极值，对应于不同的传粉综合征，即蜜蜂传粉和鸟类传粉。根据ape软件包中的MPR函数，使用最简单法对祖先传粉综合征进行重构，以估计在该植物群体上历史上发生的选择机制。
包括在系统发育中的70个鼠尾草亚属物种以及作为外类群的加利福尼亚鼠尾草用于祖先状态的重建。然后，对估计的祖先状态的树进行修剪，只包括研究中的18个分类单元。最后，模型4假设信号-奖励相关性在选择下演化为三个适应性极值。
根据Wester＆Claßen-Bockhoff [21]的方法，将鸟类传粉物种基于花部结构分为“双唇”和“管状或中间”两组。对于模型3进行了与描述相同的祖先适应性重建（电子补充材料，图S3）。
为了比较模型的拟合优度，使用对每个模型与BM模型进行的似然比检验，校正小样本量的赤池信息准则（AICc）和施瓦茨信息准则（SIC）。使用参数自举方法进行1万次模拟，计算最佳模型的参数估计（σ，α和θ）的95％置信区间。
系统发育的不确定性可能会影响的结果，特别是因为不同的拓扑结构可能导致不同的祖先选择机制重建结果。为了探究这种不确定性的影响，从系统发育树的后验分布中随机采样了1000棵树，重复了上述整个过程，并比较了四个演化模型的拟合优度。
因此，为每个模型获得了1000个不同的对数似然、AICc和SIC值，并使用这些值来检查最佳演化模型的一致性。对于一些节点的祖先状态重建也可能存在不确定性，这会对OU模型3和4的规定造成问题。
采用了两种不同的方法来处理祖先重建中的不确定性：将蜜蜂传粉状态任意地分配给所有可疑节点的祖先状态，因为从长花转变为短花（即从鸟类传粉到蜜蜂传粉）的逆转是不太可能的；
随机选择鸟类传粉和蜜蜂传粉之间的状态，并将这个任意的祖先状态分配给不确定的节点。这两种方法都应用于从系统发育树的后验分布中随机采样的1000棵树的演化模型比较中。然而，由于它们产生几乎相同的结果，假设蜜蜂传粉是所有可疑节点的祖先状态，并报告了这些结果。
结论
通过研究鼠尾草亚属的物种，对信号-奖励相关性的演化进行了深入的探究。通过发育广义最小二乘法（PGLS）分析发现，不同传粉综合征的物种在奖励、信号以及前端信号是否占优势等方面存在显著差异。
研究发现，信号和奖励之间的个体内关联构成了一种微妙的策略，从真实的信号植物到欺骗性植物都有存在，而这两个极端都可以存在于同一植物种群中。因此，这些特征可能是植物信号策略的适应性进化基础。
对于不同传粉者群体对应不同适应性最优解的证据支持了这些特征的适应性作用，并为研究植物信号诚实性的进化提供了新的研究方向。未来的研究应该使用例如操纵性实验等方法，对同时由蜜蜂和蜂鸟传粉的鼠尾草属物种的现代种群进行调查，以研究这些变量的变化对传粉者行为的影响，并进一步探索花朵信号和奖励之间的个体内关联的遗传基础。
本研究揭示了信号-奖励相关性在鼠尾草亚属物种中的演化模式。这一研究不仅对于理解植物与传粉者之间的相互作用和适应性进化具有重要意义，也为进一步研究植物传粉策略的演化提供了基础。未来的研究可以进一步探索其他因素对个体内信号-奖励相关性演化的影响，以及不同传粉方式之间的转变和演化机制。
参考文献
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