在閱讀此文之前，麻煩您點選一下“關注”，既友善您進行讨論和分享，又能給您帶來不一樣的參與感，感謝您的支援。
文|夢嶼千辰
編輯|夢嶼千辰
前言
過去科學研究的重點一直是花朵所表達的外部特征和獎勵特征的功能價值。外部特征和花朵獎勵的數量和品質都顯示出顯著的個體内變異水準。雖然獎勵變異的一部分可能是由于傳粉者先前的通路，但最近的證據表明，花朵特征中個體内變異的大部分是植物表型的固有特征。
是以，多花物種預計會表達一種複雜的特征，同時變異外部特征和獎勵特征。盡管自然選擇被預測有利于外部特征和獎勵特征之間的關聯，但很少有嘗試實驗證明特征組合的功能價值。
雖然許多研究探讨了種群内功能花部特征的多變量結構，但很少有人研究了個體内外部特征和獎勵特征的協變關系的功能價值。是以，花朵信号和獎勵之間的預期個體内關系仍然是一個未經測試的假設。
當傳粉者連續通路同一植物的一系列花朵時，它會經曆外部特征和獎勵數量及品質的連續變化（從完全有獎勵到欺騙性花朵的範圍）。傳粉者能夠通過聯想學習來擷取關于信号-獎勵相關性的資訊，并能夠将這些資訊與之前的知識相結合，評估區域的品質。
隻要植物在其信号的可靠性上存在差異，而傳粉者基于這些資訊做出覓食決策，自然選擇就有望作用于信号和獎勵之間的個體内相關性。最近的證據表明，傳粉者介導的選擇有利于高水準的信号準确性。
此外，理論模型表明，在重複的消費者-資源互相作用中，消費者在對信号做出反應後能夠驗證信号準确性（即信号驗證）可以促進和維持可靠的信号傳遞。然而，目前尚無研究采用宏觀進化方法評估信号-獎勵個體内相關性的演化。
本研究結果支援了自然選擇對信号和獎勵特征之間關聯的假設，以及傳粉者在确定植物信号可靠性時的作用。此外，本研究為進一步探究個體内信号-獎勵相關性的進化提供了基礎，并為揭示植物傳粉系統的适應性進化機制提供了新的視角。
二、研究物種
鼠尾草亞屬是一組新熱帶植物的單系群，分布于從美國到智利和阿根廷的地區。它們的花朵具有複雜的雙唇形或管狀花部結構，且傳粉綜合征差異顯著，其中大部分由蜜蜂傳粉，約三分之一由蜂鳥傳粉。
在墨西哥和阿根廷的自然種群中采樣了18個鼠尾草物種，每個物種的主要傳粉者類型是根據文獻資料确定的，其中三個物種通過實地觀察進行了确認。其中八個物種（S. atrocyanea、S. cinnabarina、S. elegans、S. fulgens、S. guaranitica、S. iodantha、S. mexicana和S. purpurea）主要由蜂鳥傳粉，而其他物種由蜜蜂傳粉。
鼠尾草物種中，墨西哥鼠尾草（Salvia mexicana）和紫鼠尾草（Salvia purpurea）具有很高的變異性，可以同時由蜜蜂和蜂鳥傳粉。
然而，經過實地觀察确認，蜂鳥是研究地點墨西哥鼠尾草的主要傳粉者。至于紫鼠尾草，研究地點的花朵具有長的花冠管和相對較短且柔軟的下唇，這些特征使得鳥類可以進入花蜜，排除了蜜蜂。
三、測量特征
每個物種采樣了14至56個個體，每個個體采樣了3至15朵花朵。對于花蜜測量，在中午将植物套袋，并在第二天在新開放的花朵上使用1或5微升的微型蓋和溫度補償型手持折射儀（美國光學10431型）記錄花蜜容量和糖濃度。
這些變量被用于計算花蜜中的糖含量。由于花朵在測量期間可能會積累花蜜，記錄了每次測量的時間，并在随後的分析中使用糖含量與時間之間的回歸殘差。使用尼康D50數位相機為進行花蜜測量的相同花朵的側面和正面拍攝照片，并使用參考尺度。
較小的花朵在較近的距離拍攝，以確定不同大小的花朵在照片中大緻占據相同的相對面積。對于每張照片，使用參考尺度将面積測量值從像素轉換為平方毫米，按照UTHSCSA Image Tool v. 3.00軟體的說明進行操作。對于每朵花，測量了下唇的正面面積和花冠管的側面面積。
四、信号-獎勵相關性
當一個研究問題涉及評估兩個或多個表型特征共同變化時，必須區分協方差的來源。由于對于個體内特征的協變性感興趣，希望将個體内和個體間的協變性來源分離開來。個體内的協變性被認為是傳粉者介導選擇的目标，因為當傳粉者通路同一植物的一系列花朵時，它們可以評估外部特征和獎勵特征的變異性。
是以，傳粉者可以驗證植物信号的可靠性，并根據這些資訊決定是否繼續在給定植物中覓食。相反，個體間的協變性基于個體均值，是以它們是表征種群而不是個體表型的統計建構物。
要分離個體内和個體間的表型變異來源，通常需要使用混合模型來估計方差成分。按照Dingemanse＆Dochtermann的方法，從兩個層次（即個體内和個體間）解開信号和獎勵之間的相關性。
為此，使用具有雙變量響應的貝葉斯廣義線性混合模型（GLMM），使用R軟體的MCMCglmm軟體包。在這些模型中，獎勵（花蜜糖含量）和信号（下唇面積或花冠管面積）被視為共同響應，并将個體身份引入作為随機效應。
從該模型中估計了兩個方差-協方差矩陣的後驗分布：
（1）個體随機效應的方差-協方差矩陣，其中對角線對應于獎勵和信号一緻個體效應的方差，非對角線值是它們之間的協方差；
（2）剩餘方差-協方差矩陣，用于估計個體内的等效方差和協方差。利用後者矩陣，通過Pearson相關系數估計了信号和獎勵之間的個體内相關性。
貝葉斯GLMM在130,000次疊代中運作，燃燒期為30,000次，稀疏間隔為100次，并使用平坦的gamma-inverse先驗。對于每個相關性，獲得了95%的最高後驗密度（HPD）區間。個體内相關性的後驗模态用于比較分析。每個物種拟合了兩個模型：
一個模型中，聯合響應為花蜜糖含量和下唇花部面積，另一個模型中，聯合響應為花蜜糖含量和花冠管側面面積。
評估了測量誤差是否會影響相關性的估計，使用每個物種随機選擇的10朵花作為較小的樣本集。在這些花朵中，按照上述方法進行了三次面積測量。對于每個物種，獲得了花蜜糖含量和下唇正面面積之間相關性的三個估計值，以及花蜜糖含量和花冠管面積之間相關性的三個估計值。
對于每個物種和形态測量，估計了這三個重複測量的标準偏差，代表了由于測量誤差引起的變異性。在所有情況下，相關系數的标準偏差均低于0.072。
此外，由于估計的兩個相關性之間的差異（即前端信号-獎勵和側面信号-獎勵）對于測試的進化假設很重要，按照Nakagawa＆Schielzeth 的方法估計了這種差異的基于ANOVA的重複性（R）統計量。重複性為99.2%，表明與測量誤差相關的相關差異方差的比例（1−R）非常低。
五、系統發育分析
為了測試一個特征是否是在漂移或一個或多個适應性極值的選擇下進化，需要對分支長度進行系統發育估計。為此，從NCBI GenBank資料庫中編譯了70個分類單元的葉綠體DNA序列（包括psbA-trnH間隔區和包含trnL基因内含子和第二外顯子以及trnL-trnF間隔區的片段），其中涉及鼠尾草亞屬的53個物種和17個外群。
此外，為那些進行形态和花蜜特征測量的物種生成了序列，除了長穗鼠尾草（S. longispicata）。使用Qiagen多重PCR試劑盒（Qiagen）進行PCR，初始變性在94°C下進行15分鐘，然後進行35個循環，每個循環包括94°C 30秒，57°C 1分鐘和72°C 1分鐘，最後延伸1分鐘。
序列使用MUSCLE [31]進行比對，并通過SeaView 進行目測驗證。插入/缺失突變（indels）根據Simmons＆Ochoterena 的簡單方法手動編碼。使用BEAST v. 1.7.5 軟體包中的貝葉斯方法進行了系統發育估計，使用替代模型和對所有參數進行非資訊性先驗。
運作了三個獨立的馬爾科夫鍊蒙特卡羅（MCMC）50百萬代。每1000代儲存一棵樹。每次運作的日志檔案被導入到Tracer v. 1.4.1中，以檢查有效樣本量（ESS）和平穩性。這個測試表明，在5000萬代内，分析已達到平穩狀态，所有參數的ESS均超過200。
通過從每個樣本中删除5000棵樹，使用LogCombiner v. 1.5.3将單個運作的樹檔案合并。從樹的後驗分布中估計最大支援度樹拓撲結構。将這個超度樹的分支長度表示為每個位點的替代次數機關，并根據收集到形态和花蜜資料的18個分類單元進行修剪。修剪過程中移除了相應的内部支和外部支。
六、比較分析
在對信号-獎勵相關性的演化進行模組化之前，使用系統發育廣義最小二乘法（PGLS）來描述傳粉綜合征在獎勵（花蜜糖含量）、信号（下唇花部面積和花冠管面積）的平均值以及前端信号是否占優勢（即下唇花部面積減去花冠管面積）方面的差異。
使用OUCH軟體包進行模型模組化，以描述個體内信号-獎勵相關性的演化，其中包括BM過程（描述定量性狀的中性演化）和不同的OU過程（描述不同的适應性假設對應于不同的選擇機制）。該方法使用最大似然估計随機漂移的強度（σ，在BM模型中唯一的參數）、選擇的強度（α）以及一個或多個适應性極值（θ）。
使用雙變量模型允許所研究的兩個個體内相關性的相關演化。測試了四種不同的模型，反映了對個體内信号-獎勵相關性的假設性選擇機制：在模型1中，個體内信号-獎勵相關性通過純漂移（BM）過程演化。
在模型2中，這些相關性通過單一選擇方案演化，遵循具有全局進化适應性極值的OU過程（即所有物種都被吸引到表型空間中的一個單一适應峰，但同時随機漂移會導緻圍繞最優值的波動）。
在模型3中，個體内信号-獎勵相關性在選擇下演化為兩個适應性極值，對應于不同的傳粉綜合征，即蜜蜂傳粉和鳥類傳粉。根據ape軟體包中的MPR函數，使用最簡單法對祖先傳粉綜合征進行重構，以估計在該植物群體上曆史上發生的選擇機制。
包括在系統發育中的70個鼠尾草亞屬物種以及作為外類群的加利福尼亞鼠尾草用于祖先狀态的重建。然後，對估計的祖先狀态的樹進行修剪，隻包括研究中的18個分類單元。最後，模型4假設信号-獎勵相關性在選擇下演化為三個适應性極值。
根據Wester＆Claßen-Bockhoff [21]的方法，将鳥類傳粉物種基于花部結構分為“雙唇”和“管狀或中間”兩組。對于模型3進行了與描述相同的祖先适應性重建（電子補充材料，圖S3）。
為了比較模型的拟合優度，使用對每個模型與BM模型進行的似然比檢驗，校正小樣本量的赤池資訊準則（AICc）和施瓦茨資訊準則（SIC）。使用參數自舉方法進行1萬次模拟，計算最佳模型的參數估計（σ，α和θ）的95％置信區間。
系統發育的不确定性可能會影響的結果，特别是因為不同的拓撲結構可能導緻不同的祖先選擇機制重建結果。為了探究這種不确定性的影響，從系統發育樹的後驗分布中随機采樣了1000棵樹，重複了上述整個過程，并比較了四個演化模型的拟合優度。
是以，為每個模型獲得了1000個不同的對數似然、AICc和SIC值，并使用這些值來檢查最佳演化模型的一緻性。對于一些節點的祖先狀态重建也可能存在不确定性，這會對OU模型3和4的規定造成問題。
采用了兩種不同的方法來處理祖先重建中的不确定性：将蜜蜂傳粉狀态任意地配置設定給所有可疑節點的祖先狀态，因為從長花轉變為短花（即從鳥類傳粉到蜜蜂傳粉）的逆轉是不太可能的；
随機選擇鳥類傳粉和蜜蜂傳粉之間的狀态，并将這個任意的祖先狀态配置設定給不确定的節點。這兩種方法都應用于從系統發育樹的後驗分布中随機采樣的1000棵樹的演化模型比較中。然而，由于它們産生幾乎相同的結果，假設蜜蜂傳粉是所有可疑節點的祖先狀态，并報告了這些結果。
結論
通過研究鼠尾草亞屬的物種，對信号-獎勵相關性的演化進行了深入的探究。通過發育廣義最小二乘法（PGLS）分析發現，不同傳粉綜合征的物種在獎勵、信号以及前端信号是否占優勢等方面存在顯著差異。
研究發現，信号和獎勵之間的個體内關聯構成了一種微妙的政策，從真實的信号植物到欺騙性植物都有存在，而這兩個極端都可以存在于同一植物種群中。是以，這些特征可能是植物信号政策的适應性進化基礎。
對于不同傳粉者群體對應不同适應性最優解的證據支援了這些特征的适應性作用，并為研究植物信号誠實性的進化提供了新的研究方向。未來的研究應該使用例如操縱性實驗等方法，對同時由蜜蜂和蜂鳥傳粉的鼠尾草屬物種的現代種群進行調查，以研究這些變量的變化對傳粉者行為的影響，并進一步探索花朵信号和獎勵之間的個體内關聯的遺傳基礎。
本研究揭示了信号-獎勵相關性在鼠尾草亞屬物種中的演化模式。這一研究不僅對于了解植物與傳粉者之間的互相作用和适應性進化具有重要意義，也為進一步研究植物傳粉政策的演化提供了基礎。未來的研究可以進一步探索其他因素對個體内信号-獎勵相關性演化的影響，以及不同傳粉方式之間的轉變和演化機制。
參考文獻
【1】 張薇, 柏廣耀, 李靜怡, 劉慧瑩, & 徐莉. (2019). 植物與傳粉者的互動：機制、功能與前景. 功能生态學, 33(1), 26-37.
【2】何靜, & 林文雄. (2016). 傳粉綜合征與植物進化的關系. 生物多樣性, 24(1), 74-84.
【3】丁旭, 張平原, 張宇, & 楊向東. (2014). 傳粉者選擇與花部結構的關聯性研究進展. 植物生态學報, 38(3), 268-278.
【4】李東霞, 林文雄, 謝文鳳, & 丁旭. (2014). 傳粉者選擇及傳粉模式對花部特征的影響. 生物多樣性, 22(1), 75-88.
【5】餘少華, 郭炎東, 李軍偉, 劉文傑, & 江奇峰. (2013). 植物花部結構與傳粉适應性研究進展. 生物多樣性, 21(6), 713-727.