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前言
本研究开发了一种新的方法，利用AET和CRISPR/Cas9系统高效产生突变狨猴。我们从自然交配的雌性狨猴的输卵管中回收胚胎，注射Cas9/guide RNA，并将其转移至供体的输卵管中。我们应用了这种新方法，仅利用包括14个无产雌性在内的18个雌性，成功生成了6只携带脆性X智力低下1（FMR1）基因突变的狨猴。
自体胚胎移植（Autologous Embryo Transfer，AET）作为一种辅助生殖技术，用于将受精卵从一个个体的生殖系统移植到同一个个体的生殖系统中, 结合CRISPR/Cas9技术，可以实现高效的基因编辑。
一、实验目的
目前，大多数用于人类疾病的基因工程动物模型是使用容易进行基因工程的小鼠生成的。然而，基因工程小鼠无法复制人类疾病的所有症状。因此，人们期望能对与人类最密切相关的非人灵长类动物进行基因工程研究。
在非人灵长类动物中，有几份关于Macaca属（如恒河猴和短尾猴）基因组编辑的报告，用于生成疾病的动物模型：使用转录激活子样效应核酸酶（TALEN）的MECP2敲除猴1，RAG1和PPARG敲除猴2，BMAL1敲除猴3和PKD1敲除猴4，这些研究都使用了CRISPR/Cas9技术。
普通狨猴（Callithrix jacchus）是适合生产基因改造动物的非人灵长类动物物种，因为其体型较小且具有较高的繁殖能力。通过病毒感染和基因组编辑，成功地产生了转基因和敲除狨猴。传统的产生突变狨猴的方法包括以下步骤：
（1）从一组名为供体的雌性动物的卵巢收集卵母细胞，
（2）体外成熟卵母细胞并与雄性动物的精子体外受精，
（3）将DNA、RNA或基因组编辑方法（如TALEN和CRISPR/Cas9系统）的蛋白质微注射到胚胎中，并在体外培养数天，
（4）将注射的胚胎移植到另一组名为受体的雌性动物的子宫中。传统方法需要较长时间的体外培养以及大量的供体和受体动物。
此外，由于这些方法需要产子的雌性作为受体，所以在雌性数量有限的实验室中使用这些方法较为困难。
自体胚胎移植（AET）是人类辅助生殖技术中常规使用的方法，主要用于治疗不孕症。然而，将AET应用于实验动物的情况相对有限，但尚未应用于非人灵长类动物。
通过结合CRISPR/Cas9系统的AET方法，高效产生突变狨猴。从自然交配的雌性动物中收集原核期胚胎，然后把基因组编辑的胚胎自体地转移到提供胚胎的雌性动物的输卵管中，再利用未经产子的雌性动物作为受体。这种AET方法可以将体外培养胚胎的时间缩短到不到30分钟，从而提高注射胚胎的发育效率。
二、实验方法
2.1实验对象
普通狨猴（Callithrix jacchus）由CLEA Japan Inc.（日本东京）购买，并在温度保持在28°C的条件下，进行12小时的光照/黑暗循环（08:00开灯，20:00关灯），食物和水供应充足。实验使用2至8岁之间的动物。通过测量血液中孕酮（[P4]）的浓度，使用竞争性酶免疫测定（ST AIA-PACK PROGII；东草公司），监测动物的发情周期。该研究还遵守了适用于动物的ARRIVE（动物研究：对体内实验的报告）准则。
2.2验证gRNA
我们验证了针对编码31个氨基酸残基（相当于人类FMRP蛋白的氨基酸残基36-66，97%同源性）的外显子的gRNA的效率（FMR1-T5；GAGGTGGGAATCTGACATCATGG）。使用CRISPRMAX转染试剂（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）将SpCas9/gRNA复合物转染到狨猴胚胎干细胞（CMES40（AES0166），RIKEN BRC CELL BANK）14中。在转染后的四天，从转染的细胞中提取基因组DNA。使用引物：
（1′-GGGGGTCACACTTAACCAAGAGTTGATGGC-5′，
3′-CTAGTGGGCAAAGAAACTTGAGGCAGGGAC-5′）
进行FMR1位点的PCR，PCR条件如下：94°C保持2分钟，30个循环，98°C溶解10秒，退火和68°C延伸50秒，最后在68°C延伸2分钟。使用突变检测套件（Takara Bio USA，Mountain View，CA）的溶解酶对PCR产物进行消化，并在2％琼脂糖凝胶中分离。
2.3胚胎采集、微注射和移植
胚胎采集中，我们使用了已生产（n=4）和未生产（n=14）的雌性狨猴。为了重置雌性狨猴的发情周期，给予前列腺素类似物克洛普罗斯特诺（Estrumate；MSD Animal Health）（第0天）。第1天，我们确认[P4]小于10 ng/ml。从第6天开始，雌性狨猴与成熟的雄性狨猴交配。从第8天开始，每天检查雌性狨猴的阴道是否有精子以确认交配。确认交配后，使用竞争性酶免疫测定（ST AIA-PACK iE2和ST AIA-PACK PROGII；东草公司）每天监测血液中的雌二醇浓度（[E2]）和[P4]。当[P4]相对于前一天增加并[E2]相对于前一天下降时，从输卵管收集胚胎，方法略有修改，先前有报道15。激素浓度的结果以均值±SEM表示。
通过中线腹切术将输卵管和卵巢外露，并放置在一个60毫米培养皿中。我们在输卵管的狭部插入一个27号翼针，并用约2毫升含有9.1毫克/毫升透明质酸酶（MilliporeSigma，慕尼黑，德国）、91单位/毫升肝素（Mochida，东京，日本）和0.091％聚乙烯醇（MilliporeSigma）的OptiMEM培养基（Thermo Fisher Scientific）冲洗两次。胚胎在Cleav培养基（Origio，马洛夫，丹麦）中培养，温度保持在38°C，氧气浓度为5％，二氧化碳浓度为5％，除了微注射时。
对于狨猴胚胎的注射，我们准备了SpCas9蛋白（100 ng/μl；Takara Bio，草津，日本）/crRNA（50 ng/μl；Integrated DNA Technologies（IDT），东京，日本）/tracrRNA（50 ng/μl；IDT）混合物和SpCas9蛋白（100 ng/μl；Takara）/sgRNA（50 ng/μl；Fasmac，厚木，日本）混合物。将SpCas9蛋白和gRNA的混合物注入收集的胚胎的细胞质中，使用M2培养基（MilliporeSigma）进行注射。注射的胚胎被自体移植到提供胚胎的输卵管中。在体外操作胚胎的时间不超过30分钟。胚胎移植后一个月，通过超声波检查确认妊娠。每周通过测量尿液中的[P4]来监测妊娠的维持情况。
2.4Western blot分析
纤维细胞在包含20 mM Tris-HCl（pH 7.4）、1 mM EDTA、1％NP-40、150 mM NaCl、0.5％次胆汁酸盐、0.1％SDS和蛋白酶抑制剂（cOmplete Mini，EDTA-free；Roche）的缓冲液中均质化。整个大脑在包含0.32 M蔗糖、10 mM Tris-HCl（pH 7.4）、1 mM EDTA和蛋白酶抑制剂的缓冲液中均质化。将10微克蛋白质进行SDS-PAGE分离，并转移到Immobilon-P膜（Merk Millipore，Burlington，MA）。膜上用兔抗人FMRP C端序列抗体（Abcam，ab17722）或鼠抗β-actin抗体（MilliporeSigma，A2228）进行探针，随后使用抗兔或抗鼠HRP标记的二级抗体。使用ECL Prime检测试剂（GE Healthcare，Chicago，IL，RPN2232）可可视化结合的抗体。将印迹使用ChemiDoc成像系统（Bio-Rad，Hercules，CA）或ImageQuant LAS 4000系统（GE Healthcare）进行成像。
三、实验结果
由于有报道称通过自然交配获得的狨猴胚胎的发育潜力比体外受精获得的胚胎要好，我们计划从自然交配的雌性狨猴中收集胚胎。我们优化了胚胎采集方案，以最大限度地获取适合基因组编辑生成突变体的卵裂期胚胎。
给予雌性狨猴前列腺素F2α（PGF2α）类似物以重置发情周期。在第1天，确认孕酮浓度（[P4]）低于10 ng/ml。在第6天，雌性狨猴开始与成熟雄性狨猴交配。确认阴道中有精子后，我们每天监测血液中的雌二醇浓度（[E2]）和[P4]。在11-13天，当[P4]相对于前一天增加而[E2]相对减少时，从18只雌性狨猴的输卵管中收集胚胎（[E2] = 0.21 ± 0.06 ng/ml（n = 7），<检测限（0.02 ng/ml；n = 11）；[P4] = 5.6 ± 1.0 ng/ml（n = 18））。我们从18只自然交配的雌性狨猴中收集到36个胚胎。其中29个（81%）胚胎处于卵裂期。每只动物的平均卵裂期胚胎数量为1.5（有产经历，n = 4）和1.6（无产经历，n = 14），这表明无产经历的雌性狨猴可以作为胚胎供体。
从自然交配雌性狨猴的输卵管中恢复的胚胎。（a）从18只自然交配雌性狨猴中恢复了36个胚胎。其中29个（81%）处于卵裂期（P.N.）。（b）通过冲洗自然交配雌性狨猴的输卵管获得的一个卵裂期胚胎。可以观察到两个原核。刻度尺为50μm。
这些结果表明，我们成功地从自然交配的狨猴中收集到了大量的卵裂期胚胎，其中81%的胚胎处于最理想的发育阶段——卵裂期。此外，我们发现无产经历的雌性狨猴同样可以作为胚胎供体，为基因组编辑研究提供了更多的选择。
四、结论
我们成功产生了6只FMR1突变狨猴，并发现其中5只突变狨猴在8天大时表达不可检测的FMRP蛋白，与Fmr1敲除小鼠的明显正常发育形成对比。在大多数脆性X综合症患者中，FMR1基因5'非翻译区的三联重复（CGG）异常扩增导致高甲基化，从而抑制转录。另一方面，患者中偶尔可观察到FMR1位点的缺失变异。
因此，本研究观察到的FMR1敲除狨猴的新生儿死亡可能是普通狨猴特有的表型。我们计划通过交配杂合突变雄性（#286）和野生型雌性，或使用AET进行ICSI，获得FMR1杂合突变雌性。女性脆性X综合症患者携带杂合突变，并且表现出比雄性患者携带半合子患者症状较轻。因此，雌性FMR1突变后代有可能在新生儿阶段存活下来，以分析FMRP降低对与脆性X综合症症状相关的高级脑功能的影响。
参考文献：
- Hammond，L.S.，Macias，M.M.，Tarleton，J.C.&Pai，G.S.《脆性X综合征和FMR1中的缺失：新病例》430–434 （1997）.
- 2. Bernardet，M.&Crusio，W.E.Fmr1 KO《小鼠作为自闭症特征的可能模型》1164–1176 （2006）.
- 3.Tomioka, I. et al. Transgenic monkey model of the polyglutamine diseases recapitulating progressive neurological symptoms. eNeuro 4, e0250-e1216 (2017).
- 4. Hagerman, R. J. et al. 《脆性X综合征》国家修订版（2017）.