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前言
本研究開發了一種新的方法，利用AET和CRISPR/Cas9系統高效産生突變狨猴。我們從自然交配的雌性狨猴的輸卵管中回收胚胎，注射Cas9/guide RNA，并将其轉移至供體的輸卵管中。我們應用了這種新方法，僅利用包括14個無産雌性在内的18個雌性，成功生成了6隻攜帶脆性X智力低下1（FMR1）基因突變的狨猴。
自體胚胎移植（Autologous Embryo Transfer，AET）作為一種輔助生殖技術，用于将受精卵從一個個體的生殖系統移植到同一個個體的生殖系統中, 結合CRISPR/Cas9技術，可以實作高效的基因編輯。
一、實驗目的
目前，大多數用于人類疾病的基因工程動物模型是使用容易進行基因工程的小鼠生成的。然而，基因工程小鼠無法複制人類疾病的所有症狀。是以，人們期望能對與人類最密切相關的非人靈長類動物進行基因工程研究。
在非人靈長類動物中，有幾份關于Macaca屬（如恒河猴和短尾猴）基因組編輯的報告，用于生成疾病的動物模型：使用轉錄激活子樣效應核酸酶（TALEN）的MECP2敲除猴1，RAG1和PPARG敲除猴2，BMAL1敲除猴3和PKD1敲除猴4，這些研究都使用了CRISPR/Cas9技術。
普通狨猴（Callithrix jacchus）是适合生産基因改造動物的非人靈長類動物物種，因為其體型較小且具有較高的繁殖能力。通過病毒感染和基因組編輯，成功地産生了轉基因和敲除狨猴。傳統的産生突變狨猴的方法包括以下步驟：
（1）從一組名為供體的雌性動物的卵巢收集卵母細胞，
（2）體外成熟卵母細胞并與雄性動物的精子體外受精，
（3）将DNA、RNA或基因組編輯方法（如TALEN和CRISPR/Cas9系統）的蛋白質微注射到胚胎中，并在體外培養數天，
（4）将注射的胚胎移植到另一組名為受體的雌性動物的子宮中。傳統方法需要較長時間的體外培養以及大量的供體和受體動物。
此外，由于這些方法需要産子的雌性作為受體，是以在雌性數量有限的實驗室中使用這些方法較為困難。
自體胚胎移植（AET）是人類輔助生殖技術中正常使用的方法，主要用于治療不孕症。然而，将AET應用于實驗動物的情況相對有限，但尚未應用于非人靈長類動物。
通過結合CRISPR/Cas9系統的AET方法，高效産生突變狨猴。從自然交配的雌性動物中收集原核期胚胎，然後把基因組編輯的胚胎自體地轉移到提供胚胎的雌性動物的輸卵管中，再利用未經産子的雌性動物作為受體。這種AET方法可以将體外培養胚胎的時間縮短到不到30分鐘，進而提高注射胚胎的發育效率。
二、實驗方法
2.1實驗對象
普通狨猴（Callithrix jacchus）由CLEA Japan Inc.（日本東京）購買，并在溫度保持在28°C的條件下，進行12小時的光照/黑暗循環（08:00開燈，20:00關燈），食物和水供應充足。實驗使用2至8歲之間的動物。通過測量血液中孕酮（[P4]）的濃度，使用競争性酶免疫測定（ST AIA-PACK PROGII；東草公司），監測動物的發情周期。該研究還遵守了适用于動物的ARRIVE（動物研究：對體内實驗的報告）準則。
2.2驗證gRNA
我們驗證了針對編碼31個氨基酸殘基（相當于人類FMRP蛋白的氨基酸殘基36-66，97%同源性）的外顯子的gRNA的效率（FMR1-T5；GAGGTGGGAATCTGACATCATGG）。使用CRISPRMAX轉染試劑（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）将SpCas9/gRNA複合物轉染到狨猴胚胎幹細胞（CMES40（AES0166），RIKEN BRC CELL BANK）14中。在轉染後的四天，從轉染的細胞中提取基因組DNA。使用引物：
（1′-GGGGGTCACACTTAACCAAGAGTTGATGGC-5′，
3′-CTAGTGGGCAAAGAAACTTGAGGCAGGGAC-5′）
進行FMR1位點的PCR，PCR條件如下：94°C保持2分鐘，30個循環，98°C溶解10秒，退火和68°C延伸50秒，最後在68°C延伸2分鐘。使用突變檢測套件（Takara Bio USA，Mountain View，CA）的溶解酶對PCR産物進行消化，并在2％瓊脂糖凝膠中分離。
2.3胚胎采集、微注射和移植
胚胎采集中，我們使用了已生産（n=4）和未生産（n=14）的雌性狨猴。為了重置雌性狨猴的發情周期，給予前列腺素類似物克洛普羅斯特諾（Estrumate；MSD Animal Health）（第0天）。第1天，我們确認[P4]小于10 ng/ml。從第6天開始，雌性狨猴與成熟的雄性狨猴交配。從第8天開始，每天檢查雌性狨猴的陰道是否有精子以确認交配。确認交配後，使用競争性酶免疫測定（ST AIA-PACK iE2和ST AIA-PACK PROGII；東草公司）每天監測血液中的雌二醇濃度（[E2]）和[P4]。當[P4]相對于前一天增加并[E2]相對于前一天下降時，從輸卵管收集胚胎，方法略有修改，先前有報道15。激素濃度的結果以均值±SEM表示。
通過中線腹切術将輸卵管和卵巢外露，并放置在一個60毫米培養皿中。我們在輸卵管的狹部插入一個27号翼針，并用約2毫升含有9.1毫克/毫升透明質酸酶（MilliporeSigma，慕尼黑，德國）、91機關/毫升肝素（Mochida，東京，日本）和0.091％聚乙烯醇（MilliporeSigma）的OptiMEM培養基（Thermo Fisher Scientific）沖洗兩次。胚胎在Cleav培養基（Origio，馬洛夫，丹麥）中培養，溫度保持在38°C，氧氣濃度為5％，二氧化碳濃度為5％，除了微注射時。
對于狨猴胚胎的注射，我們準備了SpCas9蛋白（100 ng/μl；Takara Bio，草津，日本）/crRNA（50 ng/μl；Integrated DNA Technologies（IDT），東京，日本）/tracrRNA（50 ng/μl；IDT）混合物和SpCas9蛋白（100 ng/μl；Takara）/sgRNA（50 ng/μl；Fasmac，厚木，日本）混合物。将SpCas9蛋白和gRNA的混合物注入收集的胚胎的細胞質中，使用M2培養基（MilliporeSigma）進行注射。注射的胚胎被自體移植到提供胚胎的輸卵管中。在體外操作胚胎的時間不超過30分鐘。胚胎移植後一個月，通過超音波檢查确認妊娠。每周通過測量尿液中的[P4]來監測妊娠的維持情況。
2.4Western blot分析
纖維細胞在包含20 mM Tris-HCl（pH 7.4）、1 mM EDTA、1％NP-40、150 mM NaCl、0.5％次膽汁酸鹽、0.1％SDS和蛋白酶抑制劑（cOmplete Mini，EDTA-free；Roche）的緩沖液中均質化。整個大腦在包含0.32 M蔗糖、10 mM Tris-HCl（pH 7.4）、1 mM EDTA和蛋白酶抑制劑的緩沖液中均質化。将10微克蛋白質進行SDS-PAGE分離，并轉移到Immobilon-P膜（Merk Millipore，Burlington，MA）。膜上用兔抗人FMRP C端序列抗體（Abcam，ab17722）或鼠抗β-actin抗體（MilliporeSigma，A2228）進行探針，随後使用抗兔或抗鼠HRP标記的二級抗體。使用ECL Prime檢測試劑（GE Healthcare，Chicago，IL，RPN2232）可可視化結合的抗體。将印迹使用ChemiDoc成像系統（Bio-Rad，Hercules，CA）或ImageQuant LAS 4000系統（GE Healthcare）進行成像。
三、實驗結果
由于有報道稱通過自然交配獲得的狨猴胚胎的發育潛力比體外受精獲得的胚胎要好，我們計劃從自然交配的雌性狨猴中收集胚胎。我們優化了胚胎采集方案，以最大限度地擷取适合基因組編輯生成突變體的卵裂期胚胎。
給予雌性狨猴前列腺素F2α（PGF2α）類似物以重置發情周期。在第1天，确認孕酮濃度（[P4]）低于10 ng/ml。在第6天，雌性狨猴開始與成熟雄性狨猴交配。确認陰道中有精子後，我們每天監測血液中的雌二醇濃度（[E2]）和[P4]。在11-13天，當[P4]相對于前一天增加而[E2]相對減少時，從18隻雌性狨猴的輸卵管中收集胚胎（[E2] = 0.21 ± 0.06 ng/ml（n = 7），<檢測限（0.02 ng/ml；n = 11）；[P4] = 5.6 ± 1.0 ng/ml（n = 18））。我們從18隻自然交配的雌性狨猴中收集到36個胚胎。其中29個（81%）胚胎處于卵裂期。每隻動物的平均卵裂期胚胎數量為1.5（有産經曆，n = 4）和1.6（無産經曆，n = 14），這表明無産經曆的雌性狨猴可以作為胚胎供體。
從自然交配雌性狨猴的輸卵管中恢複的胚胎。（a）從18隻自然交配雌性狨猴中恢複了36個胚胎。其中29個（81%）處于卵裂期（P.N.）。（b）通過沖洗自然交配雌性狨猴的輸卵管獲得的一個卵裂期胚胎。可以觀察到兩個原核。刻度尺為50μm。
這些結果表明，我們成功地從自然交配的狨猴中收集到了大量的卵裂期胚胎，其中81%的胚胎處于最理想的發育階段——卵裂期。此外，我們發現無産經曆的雌性狨猴同樣可以作為胚胎供體，為基因組編輯研究提供了更多的選擇。
四、結論
我們成功産生了6隻FMR1突變狨猴，并發現其中5隻突變狨猴在8天大時表達不可檢測的FMRP蛋白，與Fmr1敲除小鼠的明顯正常發育形成對比。在大多數脆性X綜合症患者中，FMR1基因5'非翻譯區的三聯重複（CGG）異常擴增導緻高甲基化，進而抑制轉錄。另一方面，患者中偶爾可觀察到FMR1位點的缺失變異。
是以，本研究觀察到的FMR1敲除狨猴的新生兒死亡可能是普通狨猴特有的表型。我們計劃通過交配雜合突變雄性（#286）和野生型雌性，或使用AET進行ICSI，獲得FMR1雜合突變雌性。女性脆性X綜合症患者攜帶雜合突變，并且表現出比雄性患者攜帶半合子患者症狀較輕。是以，雌性FMR1突變後代有可能在新生兒階段存活下來，以分析FMRP降低對與脆性X綜合症症狀相關的進階腦功能的影響。
參考文獻：
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