本文引用：康洁红, 常向云, 朱余蓉, 巴涛, 孙媛. 相关环状RNA与汉族2型糖尿病发生风险的关系研究. 中国全科医学[J], 2022, 25(15): 1863-1868 doi:10.12114/j.issn.1007-9572.2022.02.013
KANGJiehong, CHANGXiangyun, ZHUYurong, BATao, SUNYuan. Association of Cyclic RNAs with the Risk of Type 2 Diabetes Mellitus in Han Chinese. Chinese General Practice[J], 2022, 25(15): 1863-1868 doi:10.12114/j.issn.1007-9572.2022.02.013
糖尿病（DM）是一组由于胰岛素分泌绝对或相对不足，或外周组织对胰岛素不敏感而引起的以高血糖为特征的代谢性疾病。根据国际糖尿病联盟（IDF）公布数据，每年有超过1亿人被诊断为DM，目前全世界有4.63亿成年DM患者，按照增长趋势到2045年全球将有7亿DM患者[1,2]。2型糖尿病（T2DM）患者易出现严重并发症，给个人、家庭、社会带来巨大负担。LI等[3]于2015—2017年进行的全国第6次DM流行病学调查表明，不同民族之间DM患病率存在较大差异，其中汉族DM患病率最高（12.8%），回族最低（6.3%）。乔晓玲等[4]综述了表观遗传学可通过抑制胞吐过程对T2DM第一时相胰岛素分泌产生影响，中国T2DM患者存在遗传易感性，基因组携带的遗传信息分为两类：遗传编码信息和表观遗传信息[5]。表观遗传学是指基于非DNA序列改变所致的基因表达水平变化，如染色质重塑、组蛋白修饰、DNA甲基化、X染色体失活、非编码RNA（noncoding RNA，ncRNA）调控等[6]；ncRNA调控是表观遗传学的重要组成部分，主要包括microRNA（miRNA）、长链非编码RNA和环状RNA（circular RNAs，circRNAs）等[7]。circRNAs是新近确认的一类特殊的非编码RNA分子，其在表达模式上具有组织特异性及细胞特异性，生物发生受特定顺式作用元件及反式作用因子的调节。circRNAs具有高度稳定性、特异性和敏感性等特点，且便于检测，使其可成为糖尿病诊断和预测的潜在生物学标志物[8]。一些circRNAs还具有丰富性和进化保守性，以及较高的抗外切酶或核糖核酸酶降解的能力[9]。MEMCZAK等[10]报道表明，circRNAs与T2DM的发生、发展有密切关系，本研究通过从新疆维吾尔族T2DM[11]患者中筛选出的差异表达明显的4个候选circRNAs（hsa_circ_0005414、hsa_circ_0139634、hsa_circ_0032491、hsa_circ_0002922）在汉族T2DM患者中进行观察，探讨4个候选circRNAs在汉族T2DM患者中表达水平的变化及其作为生物标志物的潜在价值。
1 对象与方法
1.1 研究对象
选取2020年9月至2021年6月在石河子大学医学院第一附属医院内分泌代谢科及健康体检中心就诊或体检的汉族T2DM患者（T2DM组）及汉族健康者（健康对照组）。纳入标准：（1）长期居住在新疆，三代内未与其他民族通婚；（2）未合并冠心病、心肌病、恶性肿瘤、肝脏、肾脏疾病，以及急、慢性感染性疾病，未服用激素类、精神药物或类固醇类药物；（3）T2DM诊断符合1999年世界卫生组织制定的糖尿病诊断标准[12]，未使用胰岛素进行降糖治疗；（4）T2DM组与健康对照组性别、年龄相匹配。最终纳入T2DM组21例，其中男12例、女9例，年龄43~63岁，平均年龄（53.9±5.0）岁；健康对照组22例，其中男11例、女11例，年龄44~63岁，平均年龄（54.9±6.1）岁。本研究征得所有研究对象的知情同意，患者均签署知情同意书；经石河子大学医学院第一附属医院科技伦理委员会批准，伦理审批编号KJ2020-134-01。
1.2 研究方法
收集研究对象一般资料，包括性别、年龄，测定身高、体质量、血压，抽取研究对象清晨空腹外周静脉血常规送检于石河子大学医学院第一附属医院检验科，使用DT4-1B-24孔医用水平离心机以4 000 r/min离心10 min，离心半径15.6 cm，吸取离心管内上清液12 μl，根据BECKMAN COULTER AU5800系列全自动生化分析仪使用说明书测定空腹血糖（FPG）、果糖胺（FA）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）；采用罗氏COBAS 8000型电化学免疫分析仪测定空腹胰岛素（FINS）、空腹C肽（CpS）。计算胰岛素稳态模型指数（HOMA-IR），HOMA-IR=FPG×FINS/22.5。另外抽取外周静脉血5 ml，EDTA抗凝，于4 h内提取单核细胞，取EDTA管内1 ml外周静脉血加3 ml红细胞裂解液（1∶3）置于离心管内充分混匀，室温静置10 min，以4 000 r/min离心5 min，离心半径为12.3 cm，管底可见大量白色细胞沉淀，弃去上清液，再次加入1~3 ml红细胞裂解液混匀，以4 000 r/min离心3 min，离心半径12.3 cm，弃去上清液，管底白色沉淀物按照TRIZOL试剂盒（美国Invitrogen公司）说明书，提取血单核细胞的总RNA。
采用RT-PCR方法检测各组样本中候选circRNAs（hsa_circ_0005414、hsa_circ_0139634、hsa_circ_0032491、hsa_circ_0002922）水平，反应体系为40个循环，先95 ℃变性1 s，再把温度降到60 ℃、31 s进行延伸反应，以管家基因ACTB（β-actin）作为内参照，每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数为CT值，circRNAs相对表达水平用2-ΔΔCT表示，所有样本重复3次，取平均值，2-ΔΔCT越高，circRNAs表达水平越高。
1.3 统计学方法
采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以（x ±s）表示，两组间比较采用成组t检验；非正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，两组间比较采用Mann-Whitney U检验；计数资料的分析采用χ2检验；采用多元线性回归分析探究circRNAs与T2DM临床生化指标的关系；采用Logistic回归模型估计circRNAs的2-ΔΔCT变化时汉族T2DM患病风险的改变量，同时绘制受试者工作特征（ROC）曲线，通过ROC曲线下面积（AUC）判断候选circRNAs对T2DM的诊断价值。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组一般资料、生化指标及候选circRNAs相对表达水平比较
健康对照组和T2DM组性别、年龄、体质指数（BMI）、收缩压（SBP）、舒张压（DBP）、FINS、CpS、HOMA-IR、LDL-C、HDL-C比较，差异均无统计学意义（P>0.05）；T2DM组FPG、FA及hsa_circ_0032491、hsa_circ_0002922相对表达水平均高于健康对照组，hsa_circ_0005414、hsa_circ_0139634均低于健康对照组，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。
Table 1 Comparison of general information，biochemical indicators and relative expression levels of four candidate circRNAs in T2DM Han Chinese and healthy Han Chinese
2.2 多元线性回归分析探究circRNAs与糖代谢相关指标的关系
以4个候选circRNAs的相对表达量为因变量，对所有入组人群使用前进法逐步引入糖代谢相关指标FPG、FA、Log2FINS、CpS为自变量进行多元线性回归分析，结果显示，hsa_circ_0005414 2-ΔΔCT=1.835-0.171×FPG，R2=0.290；hsa_circ_0139634 2-ΔΔCT=1.878-0.438×FA，R2=0.159；hsa_circ_0032491 2-ΔΔCT=3.808+0.876×FPG-1.023×Log2FINS，R2=0.503；hsa_circ_0002922 2-ΔΔCT=0.170+0.281×FPG，R2=0.168，见表2。
Table 2 Multiple linear regression analysis of the association of four candidate circRNAs with glucose metabolism related indicators in Han Chinese
2.3 候选circRNAs诊断T2DM的ROC曲线分析
绘制候选circRNAs诊断T2DM的ROC曲线，结果显示，hsa_circ_0005414、hsa_circ_0139634、hsa_circ_0032491、hsa_circ_0002922诊断T2DM的AUC分别为0、0.199、0.968、0.844，见表3、图1。
Figure 1
Figure 1 ROC curve analysis of four candidate circRNAs in predicting T2DM in Han Chinese
Table 3 Analysis of the value of four candidate circRNAs for the diagnosis of T2DM in Han Chinese
2.4 候选circRNAs相对表达水平与汉族T2DM关联性的Logistic回归分析
以是否患有T2DM为因变量（赋值：是=1，否=0），以hsa_circ_0005414、hsa_circ_0139634、hsa_circ_0032491、hsa_circ_0002922相对表达量为自变量，行单因素Logistic回归分析，结果显示，hsa_circ_0139634相对表达水平升高可降低T2DM的患病风险（P<0.05），hsa_circ_0032491、hsa_circ_0002922相对表达水平升高可增加T2DM的患病风险（P<0.05），见表4。对单因素Logistic回归分析存在影响的基因进行多因素Logistic回归分析显示模型建立无法成立。
Table 4 Univariate Logistic regression analysis of the association of three candidate circRNAs with T2DM in Han Chinese
3 讨论
circRNAs被认为是一类特殊的非编码RNA，没有5′端帽和3′端尾，是由mRNA反向剪接产生的共价闭合RNA分子，富含miRNA结合位点，具有miRNA海绵作用，进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表达水平，这一机制被称为竞争性内源性RNA（ceRNA）机制[10，13]。有研究表明circRNAs可直接影响其宿主基因启动子区域的表观遗传状态，如乳腺癌细胞中的癌基因FLI1不仅可通过典型的癌蛋白途径转移，还通过其外显子介导的表观遗传机制驱动肿瘤转移[14]。YANG等[15]在T2DM中构建lncRNA-circRNAs-miRNA-mRNA网络机制表明单个lncRNA和circRNAs可与多个miRNA相关，然后共同调控更多的mRNA，且lncRNA和circRNAs在T2DM中起中心调控作用。
虽然近年来大量的circRNAs被发现和研究，且很多研究均表明circRNAs与T2DM的发生、发展密切相关，如ZHAO等[16]通过微阵列分析发现T2DM患者和正常对照者外周血circRNAs存在差异表达谱，并通过大样本验证了hsa_circ_0054633的灵敏度及特异度；王思思等[17]通过生物信息学技术筛选了与胰岛素信号通路相关的3个circRNAs，研究发现在T2DM患者血清中has_circ_0056891、has_circ_0063425、has_circ_0071336表达水平降低，调整多个因素后再次进行统计学分析，结果提示has_circ_0056891、has_circ_0063425、has_circ_0071336在T2DM中表达水平降低，是T2DM的独立预测因子，可能在T2DM及空腹血糖受损（IFG）的发病机制中起重要作用。徐文超等[18]研究发现在T2DM患者外周血中hsa_circ_401724表达显著上调，并通过分析得出其可能通过靶miRNAs调控相关信号通路参与T2DM的发生、发展。LIMOGE等[19]研究表明存在VPS13B基因缺陷的细胞，其脂肪细胞分化会加速，导致脂肪蓄积增加，胰岛素反应提示存在异常。宁利俐等[20]探讨了大陆成年隐匿性免疫性糖尿病（LADA）患者外周血circRNAs表达谱，研究结果表明hsa_circ_100670302、hsa_circ_0035809在LADA患者与健康者中存在明显的表达差异，hsa_circ_100670302的基因VPS13B与胰岛素抵抗（IR）相关，与健康者比较，LADA患者hsa_circ_100670302表达上调，推测hsa_circ_100670302可能通过调控VPS13B基因影响糖尿病的发生、发展，hsa_circ_0035809在T2DM、LADA患者中明显下调。综上所述，hsa_circ_100670302、hsa_circ_0035809可能成为区分LADA和健康个体的新型生物学标志物。同时也有研究表明circRNAs与糖尿病型心肌病、血管内皮功能障碍、糖尿病足、糖尿病视网膜病变、糖尿病合并抑郁症均密切相关[21,22,23,24,25,26]。
circRNAs在T2DM中的具体作用机制仍不十分明确，查阅近几年国内外相关文献，关于hsa_circ_0005414、hsa_circ_0139634、hsa_circ_0032491、hsa_circ_0002922与汉族T2DM之间关联未见报道，本研究选取hsa_circ_0005414、hsa_circ_0139634、hsa_circ_0032491、hsa_circ_0002922在汉族T2DM中进行观察，结果表明hsa_circ_0005414、hsa_circ_0139634、hsa_circ_0032491、hsa_circ_0002922在汉族T2DM组和健康对照组中表达水平存在明显差异，hsa_circ_0005414、hsa_circ_0139634在汉族T2DM组中表达水平下降，将其对汉族T2DM进行诊断价值分析，发现上述2个候选基因对汉族T2DM无明显诊断价值，但通过单因素Logistic回归分析可知hsa_circ_0139634相对表达水平升高可降低T2DM的患病风险，可以推测hsa_circ_0139634虽对汉族T2DM无诊断价值但却是汉族T2DM的独立预测因子，通过其基因表达水平的变化可以预测汉族T2DM的患病风险，从而做到提早预防，进行生活方式干预，提高汉族T2DM的早期诊断率；而hsa_circ_0005414对汉族T2DM既无诊断价值，与其患病风险也无相关性，但却在汉族T2DM患者中表达水平低下，有待学者进一步研究；hsa_circ_0032491、hsa_circ_0002922在汉族T2DM患者中表达水平明显上调，以hsa_circ_0032491最为显著，将表达上调基因对汉族T2DM的诊断价值进行分析，根据AUC提示其可作为早期诊断汉族T2DM较好的生物学标志物，同时进行单因素Logistic回归分析可知其相对表达水平升高可增加汉族T2DM的患病风险，同样可作为预测因子，且hsa_circ_0032491可根据临床检测FPG、FINS水平初步评估其基因相对表达水平，从而对汉族中有潜在患T2DM的人群进行早期患病风险评估，提早进行生活方式干预，可在一定程度上减缓T2DM的进展。而hsa_circ_0032491、hsa_circ_0002922与miRNA之间是否存在关联及其在汉族T2DM中的作用机制如何将会是后续研究的主要方向。
本研究也存在不足，选取的汉族T2DM患者未区分是否为首次诊断，也缺乏对糖耐量异常人群进行研究，同时入选例数过少，后续可进一步扩大样本量观察；在研究结果中T2DM组与健康对照组的FINS、CpS均无统计学差异，考虑是由于选取T2DM组研究对象时患者尚未使用胰岛素降糖治疗，研究对象只单纯存在胰岛素调控葡萄糖代谢能力的下降，尚未进展到胰岛β细胞功能缺陷所导致的胰岛素分泌减少。此外，本研究是单中心的横断面研究，研究对象的地理位置比较集中，其他地区的人口是否也有类似的基因表达谱，目前尚不十分清楚，随着病程的延长基因表达水平是否存在差异也不十分明确。因此，本研究结果需要在更大样本、更多样化的人群中行进一步观察和随访。相信阐明circRNAs在汉族T2DM中的具体作用机制会将DM的诊断及治疗带进全新的领域。
本文无利益冲突。
本文表格略
参考文献略
相关环状RNA与汉族2型糖尿病发生风险的关系研究