本文引用：王英南, 吴忱思, 赵乐, 张风宾, 张韶辰, 郭占军, 张瑞星. 线粒体DNA D-环区单核苷酸多态性与胃癌发病年龄的关系研究. 中国全科医学[J], 2022, 25(15): 1883-1887 doi:10.12114/j.issn.1007-9572.2022.02.003
WANGYingnan, WUChensi, ZHAOYue, ZHANGFengbin, ZHANGShaochen, GUOZhanjun, ZHANGRuixing. Single Nucleotide Polymorphisms in the Mitochondrial Displacement Loop and Age at Onset of Gastric Cancer. Chinese General Practice[J], 2022, 25(15): 1883-1887 doi:10.12114/j.issn.1007-9572.2022.02.003
胃癌（gastric cancer）是世界范围内常见的恶性肿瘤之一，发病率居恶性肿瘤第5位，死亡率居恶性肿瘤第4位，严重威胁着人们的生命健康[1]。中国更是胃癌大国，据2020年研究数据表明，中国每年新发病例45.7万，死亡病例30.0万，无论发病人数还是死亡人数，均居全球第1位，防控形势严峻[2]。目前研究表明，大多数国家40岁及以上人群的胃癌发病率在下降，而在40岁以下人群中胃癌发病率逐渐上升，且年轻胃癌患者具有起病隐匿、进展迅速、淋巴转结移早、腹膜转移率高、预后差等特点，给家庭、社会造成重大影响[3,4]。因此迫切需要探索预测胃癌发病年龄的相关因素及机制，以期在特定人群中采取更多的预防策略，降低胃癌发病率。
胃癌的形成是一个多基因、多因素参与的过程，近年来发现胃癌的发生不仅与核基因的变化相关，还与细胞核外遗传物质线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）的突变及单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）关系密切。人类mtDNA是哺乳动物细胞内唯一的核外遗传物质，由于其特殊的性质，例如缺乏组蛋白的保护以及修复系统不完善，与核内基因组相比，mtDNA更容易发生突变[5,6]。D-环区（D-Loop区）作为mtDNA转录调控位点，具有高度不稳定性，在包括胃癌等多种恶性肿瘤的研究中发现，D-Loop区是mtDNA突变和多态性的热点区域[7,8,9]。这些突变和多态性可能抑制线粒体电子传递链的传导，导致大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）释放，不断刺激细胞增殖分化，最终诱发肿瘤[10]。为进一步防控胃癌，本研究对胃癌患者外周血中的mtDNA D-Loop区进行测序分析，分析其与胃癌患者发病年龄的关系，以期寻找预测发病年龄的指标，从而针对特定人群进行早期预警及干预。
1 对象与方法
1.1 研究对象
选取2007年7月至2008年12月在河北医科大学第四医院消化内科就诊并经胃镜病理证实的各期胃癌患者150例作为研究对象。排除标准：合并其他部位肿瘤；病理类型为鳞癌、腺鳞癌、神经内分泌癌等其他病理类型。本研究经河北医科大学第四医院伦理委员会批准（MEC2008-2），患者均对本研究知情同意。
1.2 研究方法
1.2.1 资料收集
收集患者的临床特征，包括年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤部位、分化程度、TNM分期等。采集所有患者空腹外周静脉血，即刻放置在-4 ℃冰箱中恒温保存。
1.2.2 mtDNA提取、PCR扩增及基因测序
采用美国Promega公司生产的全血线粒体萃取试剂盒迅速提取mtDNA后置于-80 ℃恒温保存。经定量鉴定合格后的DNA，采用聚合酶链反应（PCR）法扩增目的片段，上游引物为：5'-CCCCATGCTTACAAGCAAGT-3'，下游引物为：5'-GCTTTGAGG AGGTAAGCTAC-3'。应用PCR预混试剂（Promega，Madison，WI，美国）、PCR仪（AS Applied Biosystems 9902，美国）进行分析，PCR具体反应条件为：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，38个循环，最后于72 ℃延伸5 min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶纯化后，采用ABI PRISM® BigDye Terminator v3.1循环测序反应试剂盒进行DNA测序。同一标本采用双向、测通、重复测序。
1.3 观察指标
分析不同临床特征胃癌患者发病年龄，胃癌患者mtDNA D-Loop区SNPs与发病年龄之间的关系，以及胃癌患者发病年龄影响因素。
1.4 统计学方法
采用SPSS 24.0统计学软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以（x±s）表示；计数资料以相对数表示，组间比较采用χ2检验；采用Kaplan-Meier法绘制胃癌患者发病年龄的生存曲线，生存曲线比较采用Log-rank检验；胃癌患者发病年龄的影响因素分析采用多因素Cox比例风险回归分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 不同临床特征胃癌患者发病年龄比较
150例胃癌患者中，<40岁6例（4.0%），40~50岁19例（12.7%），51~60岁49例（32.7%），>60岁76例（50.6%）。不同性别、肿瘤大小、肿瘤部位、TNM分期患者发病年龄比较，差异无统计学意义（P>0.05）；不同分化程度患者发病年龄比较，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。
Table 1 Comparison of age at onset in gastric cancer patients with different characteristics
2.2 胃癌患者mtDNA D-Loop区SNPs与发病年龄之间的关系
将150例胃癌患者mtDNA D-Loop区的测序结果与人类mtDNA文库记录的剑桥序列进行比对，共发现106个多态位点，将最小等位基因频率<5%的位点剔除，共得到21个SNPs位点进一步分析，分别是位点73A/G、146T/C、150C/T、152T/C、153A/G、195T/C、199T/C、204T/C、249A/del、263A/G、309C/CC、489T/C、523-524AC/del、16261C/T、16290C/T、16298T/C、16304T/C、16311T/C、16319G/A、16362T/C、16519T/C。采用Kaplan-Meier法绘制胃癌患者发病年龄的生存曲线，采用Log-rank检验分析mtDNA D-Loop区SNPs与患者发病年龄之间的关系，结果显示153A/G与患者发病年龄有关，153G基因型患者的平均发病年龄为（48.0±5.3）岁，153A基因型患者为（60.1±0.8）岁，153G基因型患者的发病年龄早于153A基因型患者，差异有统计学意义（χ2=7.757，P=0.005），见图1；其他位点SNPs与患者发病年龄的关系比较，差异无统计学意义（P>0.05）。
Figure 1
Figure 1 Survival curves associated with the age at onset for gastric cancer patients according to the 153A/G polymorphism in mitochondrial D-Loop
2.3 胃癌患者发病年龄影响因素的多因素Cox比例风险回归分析
以胃癌患者发病年龄（赋值：实测值）为因变量，以性别（赋值：男=0，女=1）、mtDNA D-Loop区153位点（赋值：G基因型=0，A基因型=1）为自变量进行多因素Cox比例风险回归分析，结果显示，mtDNA D-Loop区SNPs位点153A/G是预测胃癌患者发病年龄的影响因素（P<0.05），见表2。
Table 2 Multivariate Cox regression analysis of possible predictors associated with the age at onset of gastric cancer
3 讨论
胃癌的发病率和死亡率长期居高不下，严重威胁着人们的生命健康。虽然近几十年来胃癌的发病率逐渐下降，但年轻胃癌患者的发病率和死亡率均在增加[11]。各项研究对年轻胃癌患者的年龄定义和纳入标准不同，年轻胃癌患者常被定义为年龄<40岁或<45岁，以40岁为年龄界限，胃癌发病率从1973年1.7%的最低点增加至2015年的3.5%[12,13,14]。本研究中<40岁的胃癌患者所占比例为4%，与上述研究一致[12]。年轻胃癌具有侵袭性强、扩散快、预后不良等特点，且在病理组织分型中，以低分化腺癌、印戒细胞癌为主。HUANG等[14]筛查了3 000余例胃癌患者，结果发现年轻胃癌女性患者所占比例明显高于男性，并与Lauren弥漫型和较低的肿瘤分化有关。本研究同样发现发病年龄小的患者肿瘤分化程度较低，提示发病年龄小的患者肿瘤恶性度更高，更容易给家庭、社会造成疾病负担，因此迫切需要深入探讨预测胃癌发病年龄的因素及相关机制，以期早干预、早预防，降低年轻胃癌发病率。
胃癌的发病机制目前仍不十分清楚，可能是环境和遗传因素共同作用的结果，但有研究显示在年轻胃癌患者致病因素中，基因发挥的作用可能比环境致癌的影响更大[15]。线粒体是细胞内重要的细胞器，在细胞的新陈代谢、自由基产生、细胞凋亡、信号传导等多种生理过程中发挥着重要作用。由于mtDNA改变，包括突变、SNPs和拷贝数变异等引起的线粒体功能障碍可导致癌症、衰老和其他多种疾病的发生和发展[16]。D-Loop区是mtDNA的非编码区，其区域内包含重链复制起始点及重链、轻链转录的启动子，是mtDNA复制和转录的调控中心。D-Loop区的突变可影响线粒体功能，并在各种癌症中被广泛发现[17,18,19]。本课题组前期研究中已经发现mtDNA D-Loop区的SNPs与胃癌的发病及预后相关[20,21]。本研究发现mtDNA D-Loop区的SNPs与胃癌患者的发病年龄相关，153G基因型患者的平均发病年龄为（48.0±5.3）岁，153A基因型患者为（60.1±0.8）岁，153G基因型患者较153A基因型患者发病年龄明显偏早，进一步多因素Cox比例风险回归分析显示mtDNA D-Loop区SNPs位点153A/G是预测胃癌患者发病年龄的影响因素。LEE等[22]研究发现，mtDNA D-Loop区16311位点的多态性可作为家族性乳腺癌患者发病年龄的预测因素，16311C基因型患者较16311T基因型患者发病年龄早。KONG等[23]研究也发现，mtDNA D-Loop区248位点、524位点和16304位点的多态性与卵巢癌患者的发病年龄有关，248G、16304T基因型患者较248A、16304C基因型患者的发病年龄早，而524C基因型患者发病年龄晚于524C缺失的患者。上述研究结果均表明，mtDNA D-Loop区SNPs显示出了作为新型的预测肿瘤发病年龄的指标的潜力。同时本研究也存在一些不足，在多因素Cox比例风险回归分析中，未纳入幽门螺杆菌感染状态、饮食、饮酒等其他影响胃癌发病年龄的因素，将在今后的研究中进一步完善。
新近研究显示，线粒体作为启动和调节代谢的细胞器，其功能障碍长期以来一直被认为是导致衰老和与年龄有关的疾病的主要因素[24,25]。由于mtDNA易受到氧的作用，其较核基因更易发生突变，在衰老和与年龄相关的疾病中mtDNA不断出现点突变和缺失，随着mtDNA突变的不断积累，编码线粒体内膜中呼吸链的酶受到阻碍，使呼吸链功能下降，进一步导致更多自由基的产生，最终诱发细胞衰老[24,25]。在细胞衰老过程中，ROS和氧化应激产物不断增加，增加的ROS一方面可作为毒性分子加剧线粒体损伤，诱导体细胞mtDNA突变，导致线粒体氧化呼吸链损伤，形成恶性循环；另一方面ROS还可作为第二信使参与多种信号通路，调控基因表达，参与肿瘤细胞的凋亡、增殖、迁移、侵袭及转移等多个生物学过程[26,27]，这也是导致肿瘤发病率会随着年龄的增加而增加的重要原因之一。本研究发现的与胃癌发病年龄相关的SNPs位点153位于D-Loop高变2区（HV2，63-322np），此区域的突变可能直接影响着mtDNA的复制并引起氧化呼吸链的改变，导致高水平的ROS释放，大量的ROS刺激细胞不断增殖分化，并诱发原癌基因成为癌基因，最终导致肿瘤的发生。此外，此区域的突变可能引发线粒体呼吸能力的下降，从而引发细胞衰老，这也在一定程度上解释了为什么mtDNA D-Loop区的SNPs会与胃癌患者发病年龄相关，但153位点多态性的具体功能尚不十分清楚，仍需进一步探索。
综上所述，mtDNA D-Loop区SNPs位点153A/G可能作为胃癌发病年龄的新型预测指标，这有助于识别早期发病的胃癌患者，以便早期给予干预及预防，降低胃癌发病率。
本文无利益冲突。
本文表格略
参考文献略
线粒体DNA D-环区单核苷酸多态性与胃癌发病年龄的关系研究