一. 序言
1. 生物学特性
霍乱弧菌是革兰氏阴性菌，弧形或挑逗性，无芽细胞，有菌毛，有些菌株有膜，一端有厚而长的鞭毛，有活性。取霍乱患者的米水样粪便作为活细菌悬挂滴剂，可以看出细菌运动极其活跃，梭状或流星状运动。液体培养液滴染色镜检查，可以看到排列得像"鱼状"弧菌。人工培养后，很容易失去电弧，变成一根棒。
营养要求不高，在普通培养基中生长良好，在pH值6.8-10.2的范围内可以生长，耐碱，在pH值为8.8-9.0的碱性蛋白水或板内生长良好，因为其他细菌在这个pH值下不易生长，所以碱性蛋白水可以作为选择性增殖霍乱弧菌的培养基质。
在直径为2mm的碱性板菌落上，圆形，光滑透明。霍乱弧菌对热、干燥、阳光、化学消毒剂和酸敏感，耐低温：湿热55°C，15分钟，100°C，1-2分钟，水中0.5ppm氯15分钟可灭活;霍乱弧菌是氧导向型或醋酸厌氧菌，可在16-44°C下生长，最适宜生长温度为37°C。
2. 流行病学特征
霍乱弧菌是霍乱的病原体，霍乱是一种急性严重肠道感染，其特征是严重呕吐、腹泻、脱水、急性发作、高传染性和高死亡率，是一种国际检疫传染病。有139个血清型，其中O1和O139可引起霍乱。O1 和 O139 霍乱弧菌是霍乱（一种严重的肠道感染）的病原体。当然，人类容易患上霍乱弧菌。霍乱是由摄入被霍乱弧菌污染的食物或水引起的。进入肠道的霍乱弧菌通过鞭打运动穿过肠粘膜表面的粘液层，接近肠粘膜的上皮细胞，并通过普通细菌毛发的作用种植。肠道内的环境有利于霍乱弧菌的繁殖，产生霍乱肠毒素，导致疾病。
霍乱弧菌的主要原因是霍乱毒素（CHOLERA毒素，CT），这是已知最强的毒素，可引起大量肠液分泌，导致严重的呕吐和腹泻，使机体的水分和介电量损失，形成严重的水样腹泻综合征。霍乱弧菌引起的主要病变是由严重脱水、临床上可见的指纹皱纹、皮下组织和肌肉干邑引起的。心脏，肝脏，脾脏和其他器官被看到收缩。内脏浆膜是哑光的。肠腔高度扩张，肠内充满水样液体，肠粘膜松动，但粘膜上皮完整，无溃疡。胆囊充满粘稠的胆汁。球状和间质的毛细管扩张，肾脏的小管肿胀，退行性和坏死。其他器官也有出血，退化和其他变化。
二、检验过程
试验参考标准为SN/T 1022-2010进出口食品霍乱弧菌检测方法。本标准规定了进出口食品中霍乱弧菌的检测方法，适用于食品中霍乱弧菌的检测，以及动物饲料等食品生产加工地区环境样品中的霍乱弧菌检测。
霍乱弧菌检测程序如图1所示：
图 1
1. 介质识别和结果判断
（1） TCBS 培养基
原理：蛋白质铌、酵母浸渍粉提供碳和氮源、维生素和生长因子，氯化钠刺激弧菌生长，蔗糖是发酵糖，牛胆汁酸钠，牛胆汁粉，硫酸钠和铌酸钠和高pH值抑制革兰氏阳性菌群和大肠杆菌基团，硫酸钠和柠檬酸铁反应作为检测硫化氢产生的指标， 溴香草酚蓝和香草酚蓝是pH指示剂，琼脂是培养基的凝结剂。
使用方法：称量本品89g，煮沸溶于1000ml蒸馏水中，冷至45-50c，倒入无菌平盘中，备用。注意：不需要高压灭菌器。
结果：霍乱弧菌在TCBS上呈圆形，表面光滑，黄色，直径2mm~3mm，具体检测结果如下：
图2 非01 TCBS培养基生长结果霍乱弧菌
（2）青霉素琼脂培养基
原理：蛋白钯、锱粉提供氮源、维生素、矿物质和生长因子，蔗糖提供碳源，氯化钠用于满足霍乱弧菌盐生长的要求，同时形成高渗透压，不利于其他细菌的生长，硫酸钠能刺激弧菌生长，清中克氏阳性菌和一些革兰氏阴性菌的存在可以抑制格霉素和钾的存在 茴香和高pH值，萜烯钠可以保护霍乱弧菌免受其他抗菌物质的侵害，霍乱弧菌对酸性环境敏感。因此，pH值促进其生长;琼脂是培养基的凝固剂。
使用方法：取本品56.0g，加热搅拌溶解于1000毫升蒸馏水中，冷至50°C左右，加入无菌1%山梨酸钾溶液0.5毫升，搅拌均匀，倒入无菌平盘中备用。无需高压灭菌器。
结果：霍乱弧菌在青霉素琼脂培养基中微灰色、半透明、扁平微鼓胀，如长时间培养或室温放置，菌落中心形成黑色金属钯沉淀，具体检测结果如下：
菌落略呈蓝灰色，半透明，扁平且略呈凸起
延长培养时间后，菌落中心形成黑色金属钯矿床
（3）氯化钠三糖铁琼脂
原理：蛋白粉、牛肉蘸粉、酵母蘸粉提供碳氮源、维生素和矿物质;碱性是红色的，因为有些细菌能分解含硫氨基酸，在介质中产生硫化氢、硫化氢和铁盐反应，产生黑色铁素体沉淀，氯化钠含量较高，能促进弧菌的生长，琼脂是培养基的凝固剂。
使用方法：称量本品69.5g，加入1000ml蒸馏水，加热煮沸，制成完全溶解，试管下，121°C高压灭菌15分钟，备用。
结果：霍乱弧菌反应至下体黄色、斜黄色，不产生硫化氢，不产生气体，具体检测结果如下：
（4）氯化钠营养琼脂
原理：蛋白质坩埚和蘸牛肉粉提供微生物生长所需的碳和氮源，维生素和生长因子;
使用方法：要求本产品36.0g，热溶于1000毫升蒸馏水中，分成三角形瓶或试管，121°C高压釜15min，备用。
结果：氯化钠营养琼脂培养液中霍乱弧菌在纯化培养菌落后呈圆形，边缘半透明中心不透明，直径约3mm，具体试验结果如下5：
2. 生化鉴定及结果判断
（1） 革兰氏染色
使用的试剂：Gram的染色液试剂盒。
原理：结晶紫原染和碘液体染色后，在细胞壁上形成不溶性结晶紫色和碘络合物，革兰氏阳性菌由于细胞壁厚，肽多糖网水平较高而交联，当乙醇或丙酮脱色时由于水分的流失，网孔减少， 再加上其不含脂质，使结晶的紫色和碘络合物能牢牢地留在壁内，使其仍呈紫色，而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜脂含量高、肽多糖层薄而交联不良，遇到脱色剂后，脂肪基外膜迅速溶解， 薄而松散的肽多糖网不能阻挡结晶的紫和碘络合物的溶解，所以脱色后通过乙醇仍然是无色的，然后通过沙黄等红色染料重新染色，使革兰氏阴性菌变红。
结果：霍乱弧菌为革兰氏阴性菌，弧形或弯曲，染色结果如图6所示：
（2） 氧化酶试验
使用的试剂：氧化酶试纸。
原理：氧化酶又称细胞突致氧化酶，是细胞皮质呼吸酶系统的最终呼吸酶，氧化酶首先使细胞色素c氧化，然后这种氧化细胞介质c再氧化苯胺，产生颜色反应。用薄玻璃棒或一次性接种针头选择单个菌落，然后涂抹在试纸上。在30s内变成蓝色或蓝紫色是积极的，恒定的颜色是消极的。
结果：选择在营养琼脂上培养的单一菌落进行氧化酶检测，霍乱弧菌氧化酶阳性，结果如图7所示：
（3）生化鉴定条试验
使用的试剂：青岛海博HBI霍乱弧菌生化鉴定条（SN）。
试剂介绍：霍乱弧菌的生化鉴定。成分：ONPG，尿素酶，明胶，精氨酸双水解酶汤，鸟嘌呤脱脂酶汤，赖氨酸脱脂酶汤，氨基酸脱脂酶对照，无盐胰腺水，2%氯化钠胰腺水，6%氯化钠胰腺水，6%氯化钠胰腺水，6%氯化钠胰腺水8%氯化钠胰腺水，10%氯化钠胰腺水，靛蓝基质，1%氯化钠乳糖，1%氯化钠纤维双糖， 1%氯化钠阿拉伯糖，1%氯化钠蔗糖，1%氯化钠，42°C生长试验。（SN 标准）。
操作流程：取内2毫升无菌生理盐水试管，用接种针从氯化钠营养琼脂平板中取出部分菌落放入无菌生理盐水中，仔细研磨制成0.5小麦浑浊度的均匀细菌悬浮液，取无污染生化鉴定条，每个孔加入100ul菌悬液， 其中固体和半固体生化管采用穿孔接种，需要将小鸟碱、精氨酸、赖氨酸和氨基酸控制到无菌石蜡覆盖的液体表面。接种疫苗后，做一个标记，盖上盖子，放入底部托盘中，放置36°C±1°C培养物（42°C生长设置42°C培养物）。培养结束后，记录测试结果。具体测试结果如下：
霍乱弧菌非01生化鉴定结果表
<col>
生化项目
结果确定
生化形状
断续器
＋
黄色
8%氯化钠蛋白水
﹣
不会增长
尿素酶
10%氯化钠蛋白水
明胶
液
1%氯化钠乙二醇
红
鸟氨酸
紫色
1%氯化钠乳糖
不变颜色
赖氨酸
1%氯化钠纤维二糖
氨基酸控制
1%氯化钠阿拉伯糖
精氨酸
1%氯化钠蔗糖
无盐蛋白水
增长变得多云
靛蓝矩阵
红色戒指
2%氯化钠蛋白水
42°C生长试验
6%氯化钠蛋白水
氧化酶
注意：。。。是积极的;- 负面
注：1.靛蓝基质试验过程中，培养结束后应加入2-4滴Kovacs的靛蓝基质试剂，混合后4h内观察结果，2.Birdine、精氨酸、赖氨酸和氨基酸控制应涂覆无菌液体石蜡。
三、结果总结
霍乱弧菌在TCBS上呈圆形，表面光滑，黄色，直径2mm~3mm，微蓝灰色，半透明，扁平，在青霉素的琼脂培养基上微鼓鼓，如长时间培养或室温放置，菌落中心形成黑色金属钯反应，反应在氯化钠三糖铁的斜面上底部为黄色， 斜面上黄色，不产生硫化氢，不产生气体，菌落在氯化钠营养琼脂培养基上净化后呈圆形，边缘为半透明中心不透明，直径约3毫米;通过革兰氏染色测试确定为革兰氏阴性，弯曲或弯曲;氧化酶试纸上呈紫色，检测结果呈阳性;在无盐蛋白质水和2%氯化钠蛋白质单宁水中生长;6%氯化钠蛋白水，6%氯化钠蛋白水，水，8%氯化钠蛋白水生长呈阳性，10%氯化钠蛋白在水中不生长;ONPG是积极的;尿素酶为阴性;明胶是阳性的;birdine，赖氨酸脱脂酶是阳性的;氨基酸控制和精氨酸为阴性;蔗糖、乙二醇为乳糖阳性，纤维双糖和阿拉伯糖均呈阴性，靛蓝基质试验呈阳性，并在42°C培养箱中生长。除上述检测外，霍乱弧菌检测还可以可选血清信用型等相关检测。