本文來源：小柯生命
多囊泡體（MVBs）是細胞内的重要細胞器，在細胞品質控制中扮演着關鍵角色。MVB膜通過内陷和切割形成腔内小泡（ILVs），負責分選蛋白質貨物，這一過程按當今的了解需要ESCRT蛋白複合體消耗ATP來完成[1]。近些年研究顯示，生物分子凝聚體是細胞行使其功能必不可少的介觀結構，通過多種多樣的機制發揮作用。凝聚體可以與膜互相作用發生“潤濕（wetting）”并引發毛細（capillary）現象[2]。然而，潤濕相關毛細力在細胞過程中的生物學意義仍然知之甚少。
中原標準時間2024年10月9日23時，清華大學方曉峰實驗室與合作者在Nature雜志線上發表了題為“Biomolecular condensates mediate bending and scission of endosome membranes”的研究論文，揭示了植物蛋白FREE1相分離形成凝聚體，通過潤濕作用誘導内體膜的内陷和不穩定性，足以在不依賴ESCRT機器和ATP的情況下介導ILV的形成。
Nature雜志同期以Research Briefing的形式對該工作進行了題為“Cell membranes shaped and cut by phase-separated liquid protein condensates”的報道。
文末附專家點評：
張明傑（南方科技大學 教授、中國科學院院士）
曹曉風（中國科學院遺傳與發育生物學研究所研究員、中國科學院院士）
俞立（清華大學 教授）
李丕龍（清華大學 教授）
方曉峰實驗室專注于研究相分離形成的凝聚體在植物感覺、應答和記憶環境脅迫中的作用機制（實驗室正在招聘對此方向感興趣的博士後人員）。研究人員首先利用實驗室之前建立的相分離蛋白篩選體系[3]，發現植物ESCRT組分FREE1在體内和體外都具有很強的相分離能力，其N端内在無序區域（IDR）是驅動相分離的主要元件（圖1）。此外，FREE1具有FYVE結構域，能夠與膜脂質磷脂酰肌醇3-磷酸（PI3P）結合，進而定位到MVB膜上。進一步研究發現，凝聚體的形成顯著增強了FREE1與膜的結合能力，且FREE1凝聚體作為支架，招募ESCRT其它組分進入其凝聚體，增強它們與膜的結合能力。很重要的是，作者發現利用序列完全不同的FUS-IDR替換FREE1的IDR，能夠完全回補free1突變體緻死的表型（圖1）；而失去了相分離能力的FUS-IDRm則不能，表明FREE1的相分離是其發揮功能必要且充分的條件。然而，作者發現FUS-IDR-FREE1雖然可以替代FREE1的功能，但不能與ESCRT互相作用進而招募它們進入其凝聚體中，暗示FREE1的凝聚體可以獨立于ESCRT發揮功能。
圖1. FREE1相分離是其發揮功能所必需的。（a）不同形式FREE1蛋白的結構示意圖；（b）不同形式FREE1體外相分離實驗；（c）所示基因型植物的發育表型。
進一步，研究團隊通過體外重構和計算機模拟FREE1凝聚體與膜的互相作用，發現FREE1凝聚體可以在極短的時間内使得膜發生彎曲内陷。在體外重構實驗中，研究者觀察到在沒有ESCRT複合體存在的情況下，FREE1凝聚體填充的小膜泡可以在大膜泡GUV内側形成并在内部自由擴散（圖2），表明FREE1凝聚體本身足以介導囊泡剪切。實體理論計算發現支援這一猜測。作者進一步提供了很強的遺傳學證據：在缺失ESCRT的植物中過表達可以形成凝聚體的FUS-IDR-FREE1，發現能夠很大程度上實作MVB内ILV的形成。最後研究者還發現，盡管可以相分離但不招募ESCRT的FUS-IDR-FREE1能夠滿足植物在正常條件下的生長發育，但不能滿足植物在高鹽和幹旱等條件引起的滲透脅迫下的萌發和存活率，說明ESCRT蛋白機器和FREE1凝聚體可能是進化過程保留下來的實作MVB産生的雙保險機制，也能夠更好地應對環境的變化。脅迫條件下這兩種機制如何互相協同還有待未來進一步研究。
圖2. 多手段揭示FREE1凝聚體與膜的互相作用。（a）體外FREE1液滴（紫色）與GUV膜（綠色）的互相作用；（b）計算機模拟液滴（紫色）通過浸潤内陷膜（綠色）的動态過程；（c）實體理論計算膜頸切割所需的力與液滴大小之間的關系。
綜上，此研究揭示了一種不同于傳統認知的、由ESCRT機器消耗ATP介導的、MVB産生的新機制：FREE1相分離形成的具有液态屬性的凝聚體，通過其産生的毛細力驅動MVB膜内陷，引起膜頸的不穩定進而完成膜的剪切形成ILV，該過程不依賴ESCRT機器和且不ATP消耗（圖3）。這一研究極大地拓寬了相分離在生物學中功能研究的次元，加深了我們對細胞内膜系統重塑的了解。
圖3. 凝聚體介導ILV形成的工作模型。左邊顯示傳統認為的通過ESCRT蛋白機器與ATP酶協同實作ILV産生的過程；右邊顯示本研究發現的凝聚體通過毛細力内陷MVB膜和對膜頸的切割實作ILV産生的過程。
清華大學生命科學學院方曉峰副教授和德國科隆大學Roland Knorr教授為該文通訊作者，清華大學生命學院博士後王豔甯、李樹林和德國弗萊貝格工業大學的Marcel Mokbel博士為該文共同第一作者。日本東京工業大學Alexander May博士、德國弗萊貝格工業大學Sebastian Aland教授、英國倫敦大學學院Jaime Agudo-Canalejo教授、香港中文大學姜裡文教授及其課題組梁子臻博士、中國科學院華南植物園曾詠倫研究員和清華大學葛亮副教授等人對該工作作了重要貢獻。該工作獲得了北京自然科學基金、國家自然科學基金、德國研究聯合會、香港研究資助局和日本學術振興會等經費支援。
相關論文資訊：
https://www.nature.com/articles/s41586-024-07990-0
參考文獻
1.Vietri, M., M. Radulovic, and H. Stenmark, The many functions of ESCRTs. Nat Rev Mol Cell Biol, 2020. 21(1): p. 25-42.
2.Gouveia, B., et al., Capillary forces generated by biomolecular condensates. Nature, 2022. 609(7926): p. 255-264.
3.Zhang, H., et al., Large-scale identification of potential phase separation proteins from plants using a cell-free system. Mol Plant, 2023. 16(2): p. 310-313.
專家點評
張明傑（南方科技大學 教授、中國科學院院士）
細胞膜系統的重塑包括出芽和内陷，對細胞生命活動至關重要。膜内陷發生在細胞分裂、内體成熟、自噬、膜修複等多種生物學過程中，通常由ESCRT蛋白機器介導。ESCRT蛋白與ATP酶協作，消耗ATP驅動膜的切割或閉合。ESCRT介導内體（endosome）膜内陷形成多囊泡體（multi-vesicular body, MVB）是真核生物中高度保守的過程，在細胞器生成、蛋白質降解、病毒出芽等過程中發揮重要作用。FREE1是植物中ESCRT複合體的一個組分，之前的研究表明其參與MVB的形成，但确切功能和機制尚不完全清楚。
方曉峰實驗室建立了以解析生物凝聚體參與植物對環境脅迫感覺、應答和記憶的研究體系，系統地篩選和探究相分離蛋白的特性及其在植物脅迫響應過程中的生理功能。他實驗室最新的一項研究發現ESCRT蛋白FREE1具有極強的液-液相分離能力且遺傳證據顯示相分離能力是FREE1發揮功能必要且充分的條件。進一步研究顯示FREE1凝聚體定位在MVB的外膜上，通過招募ESCRT組分促進它們在膜上的富集。非常有意思的發現是，破壞FREE1招募ESCRT組分的能力但是保留其相分離的能力就足以實作正常生長條件下MVB的形成。作者提出大膽假設：FREE1的凝聚體可以通過與膜的互相作用，直接驅動MVB膜的内陷和切割形成内腔小泡，而不依賴ESCRT蛋白和ATP消耗。要證明這一假設是不容易的，方曉峰研究團隊與材料實體學和計算生物學方面的專家展開合作，通過體外重構、計算模拟、實體理論研究和遺傳學等手段，為這一現象提供了強有力的證據。這項研究非常好地展示了多學科交叉在生物學研究中的重要性，尤其是相分離與相變在生物學中的作用機制研究上，tei特别需要結合實體、化學、數學及其它學科，才能真正了解相分離的意義和機制，這種學科的交叉融合也應該是我們國内研究領域所應該進一步鼓勵和發展的。方曉峰實驗室的發現也提示蛋白質凝聚體通過潤濕作用有可能更廣泛地作用于細胞中囊泡的内吞和外吐，他們的研究也為未來進一步探究生物凝聚體與細胞内其它結構互作提供了借鑒和理論基礎。
曹曉風（中國科學院遺傳與發育生物學研究所研究員、中國科學院院士）
清華大學方曉峰實驗室最新一項研究發現植物細胞内FREE1蛋白相分離形成凝聚體，通過其實體屬性，即毛細力，即可實作對細胞内膜系統的重塑，這個過程不依賴我們傳統認知的蛋白質機器且不需要消耗ATP。這項研究産生了原創的重要理論，是對生物學研究知識邊界的一次勇敢探索。很顯然這樣的機制不止存在于植物的多泡小體（MVB）的形成過程，對其它物種中膜重塑過程的研究具有重要的借鑒。往往來源于植物中的科學發現容易被科學界，尤其是動物學研究領域所忽視，但我相信方曉峰團隊的這一來源于模式植物拟南芥的研究發現，能夠為動物研究領域提供非常好的啟示。另外，這項研究為真正的基礎科學研究作了一個示範，希望國内從事基礎科學研究的青年科學家能夠深度鑽研具有挑戰的科學問題，善于利用學科交叉手段解決問題。
俞立（清華大學 教授）
細胞内膜系統動态變化的研究，起源于George Palade的開創性工作。每一次對内膜動态變化與組織方式的新認識，都會催生出大量的新發現.
回顧近十年來細胞生物學的重大進展，回歸生理與數理交叉為重要特點。前者尤其依賴内膜系統的動态變化，而後者則湧現了以相分離（phase separation）為基礎的新穎機制。例如，南方科技大學張明傑團隊的研究揭示了相分離機制在短距離的運輸中的關鍵作用，揭示了一種無能量依賴的定向運輸方式。生物大分子相分離作為一個重要的研究領域，引起了科學界的廣泛關注，尤其是在膜重塑和物質運輸過程中，相分離的生理意義和機制亟待深入探究。
清華大學的方曉峰研究團隊與合作者在近期的研究中揭示了植物内體分選複合物（ESCRT）組分FREE1如何通過液态凝聚體的形式，驅動腔内囊泡（ILV）的形成。這一發現對多囊泡體（MVB）形成機制的了解具有重要意義。研究顯示，FREE1凝聚體不僅能夠獨立地介導膜的彎曲與分裂，且在缺乏ATP和ESCRT蛋白的情況下，仍能有效完成腔内囊泡的形成，該過程在哺乳動物細胞中同樣保守。這一機制的提出，為我們了解膜的動态變化提供了全新的視角，揭示了相分離在膜重塑過程中的關鍵作用。
該研究的另一個重要貢獻在于對膜的實體特性與動态過程之間關系的闡述。研究者通過實體模型與計算模拟，展示了相分離凝聚物如何通過濕潤效應（wetting）引導膜頸部的分裂。這一發現不僅加深了我們對膜分裂機制的了解，也強調了生物大分子相分離在細胞運輸中的廣泛應用潛力，特别是在應對細胞内環境變化時，凝聚物的動态調控顯得尤為重要。
自Scott Emr教授在2001年發現了首個ESCRT複合體以來，一系列的研究揭示了ESCRT途徑及其在細胞蛋白質分選、細胞分裂、病毒逃逸等的重要機制。FREE1的相分離與ESCRT蛋白的互相作用，可能為細胞内物質的選擇性運輸與代謝調控提供新的思路。随着對相分離機制的深入研究，未來我們有望揭示其在不同生理條件下的多樣化功能，為疾病防治與生物技術的應用提供新的方向。可以預見，這一領域将繼續推動細胞生物學的發展，助力我們揭示生命活動的本質與機制。
李丕龍（清華大學 教授）
在細胞中，生物大分子可以通過多價互相作用與周圍基質發生液-液相分離，進而形成富集特定蛋白和核酸的功能性液态凝聚體。近年來，蛋白凝聚體的功能研究蓬勃發展，揭示了其在細胞信号轉導、基因調控以及蛋白降解等多種生物過程中廣泛參與和顯著的優勢。一方面，相分離依賴的蛋白招募和高度富集有助于促進分子間互相作用并減少背景蛋白的幹擾，進而保證内部生化反應特異高效地進行，實作對細胞内外環境變化的迅速響應。例如突觸後緻密區通過對膜上受體和信号轉導分子的分類富集，實作信号的高效整合和傳遞。另一方面，液态凝聚體具有的力學性質，如表面張力和浸潤效應等，可以在細胞活動中直接表現為機械力，介導細胞骨架網絡組裝等耗能過程。然而，相分離形成的蛋白凝聚體與傳統分子複合物機器在功能上的關聯性和獨立性尚未得到充分闡明。
ESCRT複合物是細胞中膜重塑，特别是多泡體（MVB）形成過程中的關鍵機制。它能夠識别并招募泛素化标記的目标蛋白到MVB上，并通過組裝形成螺旋狀結構，将ATP水解釋放的能量轉化為MVB膜向内彎曲形成内腔囊泡（ILVs）并最終與外膜徹底分離的機械力。近日，清華大學生命學院方曉峰教授及合作者在Nature上發表的最新研究報道了拟南芥ESCRT相關蛋白FREE1通過相分離形成的凝聚體介導MVB中ILVs的形成。FREE1依賴其N端的IDR在MVB膜上形成凝聚體，并通過毛細作用和浸潤作用克服膜彎曲所需的能量壁壘，向内出芽形成ILVs。FREE1凝聚體具備招募ESCRT組分的能力，但值得關注的是，其招募泛素化蛋白及形成ILVs的過程并不依賴于ESCRT複合物，且拟南芥中ESCRT功能喪失造成的表型缺陷可以通過增強FREE1凝聚體形成進行回補。這些發現充分表明了依賴液-液相分離形成的蛋白凝聚體具有獨立于已知的分子複合物機器執行細胞功能的能力，并為其他細胞活動的機制研究在現有的理論架構之外提出了新的可能，為領域注入了新的活力。
前蘇聯生化學家Alexander Oparin在1936年出版的《生命的起源》一書中提出，生命起源于有機物質凝聚的液滴。受當時科學水準的局限，這一理論并未能解釋液滴自發凝聚的機理和功能。而在近一個世紀後的今天，關于液-液相分離的驅動力和液滴實體性質的基礎理論研究以及生物體中相分離依賴的功能研究成果日益豐碩，提示着原始生命可能依賴多價互作形成的生物大分子凝聚體進行基本生命活動。方曉峰及合作者這項最新研究成果進一步暗示了這一點，且鑒于蛋白凝聚體能夠介導内膜系統重塑，早期膜系統演化可能也有凝聚體的參與。此外，這項工作還發現，雖然在正常狀态下僅憑FREE1凝聚體就能滿足植物的生存需要，但在高滲環境下，隻有FREE1凝聚體和ESCRT複合物兩條途徑互相作用，協同介導MVB形成，植物才能正常生存并繁殖。這也暗示在原始生命向高等生命進化的過程中，由于需要适應複雜多變的環境，逐漸演化出液态凝聚體和分子複合物機器協同作用的機制，二者各自可以獨立行使功能，并在複雜環境下互相促進和補充，共同保證生命活動的正常進行。
編輯 | 餘 荷
排版 | 王大雪
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