前列腺癌是男性生殖系統最常見惡性惡性良性腫瘤，也是第五大男性癌症死因。2020年全球新發病例141.4萬，死亡37.5萬。中國新增11.5萬例，死亡5.1萬例。盡管中國發病率和死亡率較低，增速快，5年生存率僅69.2%，低于歐美80%以上。可能是晚期診斷預後差所緻。提高生存率需早期診斷侵襲性前列腺癌。
前列腺癌（PCa）早期診斷目前依賴PSA測試和活檢，但存在敏感性和特異性不足問題，尤其在“灰區”。這可能導緻過度診斷和治療。研究者尋求尿液中的生物标志物，如DNA、RNA、蛋白質和外泌體，以改進無創診斷方法。PSA廣泛應用于前列腺癌篩查，但存在高敏感性、低特異性問題，易受其他因素影響。PSA 4~10μg/L為灰區，難以區分良性疾病。33%轉移性PCa患者PSA在此範圍内。96%男性在2.0~10μg/L水準未患PCa。中華醫學會指南建議使用fPSA/tPSA、PSAD、PSAVE等參數提高篩查準确性，但應用條件和診斷值有争議。 彙總了近年來相關研究進展，分享新型無創前列腺癌風險預測名額的探索成果。
患者可選擇手術或放療，可能伴随副作用。低中風險患者優先考慮主動監測(AS)，定期用PSA、活檢等評估病情。液體活檢分析循環惡性良性腫瘤細胞、DNA、蛋白質和外泌體（EVs）作為生物标志物的優勢：
① EVs存在于大多數人體體液中，更易擷取；
② 具有代表組織特異性的各種分子（蛋白質、核酸，如mRNA和miRNA、脂質、代謝物等）；
③ 外泌體外包裹有磷脂雙分子層，相比于自由循環的生物标志物更穩定。
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尿液惡性良性腫瘤标志物
1.1 PCA3
PCA3是一種位于9号染色體的長鍊非編碼RNA，發現于1999年。它在前列腺癌及轉移組織中過表達，檢測PCA3與PSA mRNA濃度比值即可獲得PCA3評分。該評分是首個獲FDA準許的尿液惡性良性腫瘤标志物檢測方式。Proussard等回顧顯示PCA3診斷PCa能力強于血清PSA，AUC 0.64-0.83。
荟萃分析（54項研究，17575例患者）顯示，PCA3評分在PCa診斷中優于血清PSA：靈敏度71%、特異度68%、診斷優勢比5.28、合并AUC為0.75。
研究表明，PCA3與血清PSA的結合在前列腺癌（PCa）診斷中具有一定價值，主要幫助決策重複活檢。然而，其在評估侵襲性PCa和預後方面的應用受限。PCA3評分的最佳臨界值尚存争議：低值提高陰性預測值；高值提升陽性預測值；中等評分則存在不确定性。聯合其他标志物可能解決這一問題。
1.2 TMPRSS2-ERG
基因融合常由染色體重排引發，前列腺癌（PCa）患者中存在此類現象。2005年，Tomlins等首次發現前列腺中的TMPRSS2與ETS轉錄因子基因融合，涉及細胞功能如增殖、凋亡等。TMPRSS2-ERG融合基因在50%的PCa患者中檢測到，并可通過尿液檢測。一項109例患者的研究指出其特異性93%，陽性預測值94%，但靈敏度37%。尿液中的TMPRSS2-ERG與PCA3聯合使用提高診斷效能，靈敏度從68%提升至76%[17]。密歇根大學開發MyProstateScore（MPS）模型，基于尿液和血清名額。在1125人的隊列研究中，MPS的PCa穿刺陽性預測AUC為0.75，預測侵襲性PCa（Gleason≥7）的AUC為0.77，均優于單獨血清PSA。Sanda等[19]的前瞻性多中心隊列研究（樣本量：1077）表明，相較于單獨血清PSA，MPS評分可提高侵襲性前列腺癌（PCa）檢測率。設定95%靈敏度門檻值時，進階别PCa檢測特異性由18%增至39%，減少42%不必要的活檢。osoian等人研究顯示，MPS診斷在識别侵襲性前列腺癌中表現出高效性。當MPS＜10，靈敏度和陰性預測值高（分别為96%和97%），可減少33%的非必要活檢并僅漏診3%的侵襲性病例。TMPRSS2-ERG在預測侵襲性PCa具有臨床價值，但單獨使用靈敏度低。結合PCA3可顯著提高診斷效能。MPS的成功應用表明，多标志物聯合使用可能是提升診斷能力的有效方法。
1.3 MALAT1
"MALAT1, 位于11号染色體的長鍊非編碼RNA，與多種癌症（如肝細胞癌、肺癌、結直腸癌）及前列腺癌（PCa）侵襲性相關。Wang等研究發現，在PSA 4～10 μg/L的PCa患者中，活檢陽性者的MALAT1評分高于陰性者。MALAT1預測的準确性優于總PSA或遊離PSA/總PSA比。使用門檻值為25%時，可減少30.2%～46.5%的不必要活檢，同時不影響侵襲性PCa的診斷。MALAT1對前列腺癌(PCa)進展和轉移有重要作用，但特異性低于PCA3。研究顯示，MALAT1預測癌症進展和轉移的臨床價值高，與特異性更高的标志物聯合使用可能提高診斷效果。然而，目前臨床研究不足，需更多前瞻性研究驗證。
1.4 PSA
1985年，Graves首次發現尿液中存在PSA，但早期研究結果沖突，其診斷價值尚有争議。最新研究指出尿液PSA低表達與前列腺癌(Pca)發生和進展相關。PSA由腺泡和腺管上皮細胞産生，在癌症進展時大量釋放入血，血清PSA不能準确反映Pca組織的PSA表達。研究顯示，進階别前列腺癌(PCa)組織中PSA表達減少，與Gleason評分升高和細胞增殖增強相關。Occhipinti等在527人隊列研究發現，尿液PSA能反映前列腺組織PSA表達水準，其對侵襲性前列腺癌(PCA)的陰性和陽性預測值分别為82.8%和47.9%。尿液PSA AUC為0.691，優于标準預測模型(SOC) AUC 0.621。尿液PSA與SOC結合可提升至0.712。使用0.4門檻值可減少26%不必要活檢，漏診僅2%侵襲性PCA。PSA表達缺失與PCa分期及預後相關。尿液PSA檢測在區分PCa與良性疾病、預測分期方面有潛力。鑒于目前尿液PSA研究有限，建議進行更大樣本量驗證或結合其他标志物建立評分系統，以提高臨床診斷價值。
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基于尿液外泌體的惡性良性腫瘤标志物
外泌體：30-180nm直徑，脂質雙層膜的細胞外囊泡。廣泛存在于哺乳動物的尿液等體液中。外泌體在惡性良性腫瘤微環境、侵襲轉移和免疫逃逸中具有重要作用。它們攜帶細胞的核酸、蛋白質和代謝物，能反映源細胞特性且因其脂質雙層保護而穩定，是理想的生物标志物。
2.1 尿液外泌體惡性良性腫瘤标志物及其聯合檢測
ExoDx前列腺檢測：首個獲FDA認證的尿液外泌體活檢。通過PCA3、ERG、SPDEF檢測得EPI評分，輔助PSA篩查。EPI＞15.6高風險。無需前列腺按摩。
Donovan等[37]研究發現，ExoDx Prostate Test對初檢患者進階别前列腺癌（PCa）的陰性預測值97.5%，陽性預測值37.5%。結合EPI評分和标準操作程式（SOC）模型提升診斷價值，AUC由0.67增至0.80。驗證研究顯示，EPI評分截斷15.6時，侵襲性PCa診斷靈敏度91.9%，陰性預測值91.3%，AUC達0.71。ExoDx與SOC聯合模型AUC為0.73優于單獨SOC（AUC 0.63），可降低27%無效活檢率和漏診8%侵襲性PCa[38]。
Mckiernan等進行了504例50歲以上患者的前瞻性隊列研究，發現ExoDx Prostate Test聯合診斷模型AUC為0.71，EPI評分15.6時敏感性93%，陰性預測值89%，可減少26%前列腺活檢，總活檢率20%，誤診率7%。Mckiernan等人的最新隊列研究（n=229）發現，ExoDx Prostate Test在診斷初次活檢陰性的侵襲性前列腺癌（PCa）患者方面，EPI評分優于其他模型。EPI評分臨界值為15.6時，其陰性預測率為92%，AUC為0.66（95% CI：0.55～0.78），可減少26%的不必要活檢，僅漏診2.6%侵襲性PCa。研究顯示：71.6%白人，14.4%非裔美國人，種族多樣。缺乏針對亞洲尤其是中國人群的ExoDx前列腺測試評估。
2.2 尿液外泌體中的微RNA
miRNA是約22個核苷酸的非編碼單鍊RNA，調控基因表達。因與惡性良性腫瘤細胞多種功能相關，其作為惡性良性腫瘤标志物潛力大。Samsonov[43]和Foj[44]的研究發現PCa患者尿液外泌體中miRNA表達差異，可能因分離方法不同。聯合檢測miR-21和miR-375具有較高診斷效能（AUC=0.872），但需進一步臨床驗證。Rodríguez等人的研究發現，PCa患者尿液外泌體中5種miRNA表達下降，尤其是miR-196a-5p和miR-501-3p可用于診斷。尿液外泌體miRNA作為前列腺癌（PCa）診斷标志物的研究剛開始，面臨分離方法标準化難題。但其潛力巨大，有望改善PCa早期診斷和預後。 尿液惡性良性腫瘤标志物在早期PCa診斷中潛力巨大，多種标志物聯合使用可提高診斷效果。然而，缺乏新興标志物間的直接對比資料，不同研究的比較因尿液收集和樣本處理差異而受限。此外，歐美與亞洲人群PCa遺傳特征差異明顯，對亞洲人群的最佳截斷值和診斷效能評估需進一步大規模臨床研究支援。PCa尿液活檢雖有限，但提供有價值的非侵入性癌症檢測，助早期發現侵襲性PCa，減少不必要的穿刺活檢和醫療資源浪費。未來或改變診斷治療模式，需大規模前瞻性研究驗證。
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基于尿液外泌體的惡性良性腫瘤标志物
尿液exosomal miR-375：
miRNA是18-25核苷酸長的非編碼單鍊小RNA，通過與3'-UTR互補配對降解或抑制翻譯，調控基因表達。其異常表達與惡性良性腫瘤相關，可作為生物标志物。miRNA通過外泌體在惡性良性腫瘤細胞間傳遞資訊。外泌體是30~100nm的膜囊泡細胞，廣泛存在于體液中，含特異性蛋白、mRNA和miRNA，調節受體細胞行為，可作為疾病分子标志物。研究表明尿液外泌體中的miRNA反映細胞起源，适合作為前列腺癌等癌症的非侵入性分子标志物。MiR-375是胰腺來源的miRNA，在前列腺癌中異常表達。
研究表明，前列腺癌患者的尿液中exosomal miR-375表達量顯著低于BPH患者和健康人（P<0.01），但BPH組與對照組間無顯著差異（P>0.05）。這表明尿液exosomal miR-375可能作為前列腺癌的非侵入性診斷标志物。盡管已有其他研究探讨miR-375在前列腺癌中的潛力，但其作為尿液生物标志物的診斷價值尚未被報道。
尿液CXCL16：
新惡性良性腫瘤标志物有助于前列腺癌早期篩查和診斷，尤其在PSA灰區患者中。通過結合PSAD、fPSA%和尿液CXCL16，提高診斷準确性。
趨化因子配體16（Chemokine（C-X-C motif）ligand16，CXCL16在前列腺癌組織和血液中高表達，是潛在的惡性良性腫瘤标記物。研究發現，聯合檢測血清PSA及其參數（fPSA、fPSA%、PSAD）和尿液中CXCL16可提高灰區前列腺癌診斷的特異度、陽性預測值、陰性預測值和準确度。
DD3PCA3:
DD3，現稱PCA3，是1999年被發現的前列腺特異性基因。它位于9q21～22染色體，表達一種無蛋白産物的非編碼mRNA。PCA3與前列腺癌（PCa）密切相關，其在PCa組織中的表達量顯著高于正常前列腺組織及其他疾病組織。研究表明，PCA3是PCa的特異标志基因。 DD3PCA3基因在前列腺癌細胞中表達強烈，可從癌症細胞中排出并穩定存在于血液、前列腺按摩液、精液和尿液中。通過尿液檢測該基因，2003年Hessels等人研究顯示前列腺癌患者的DD3PCA3水準遠高于非癌症個體，表明通過尿液檢測可有效診斷前列腺癌。
Fradet等人使用uPM3方法通過檢測尿液中的DD3PCA3 RNA和PSA mRNA提高了前列腺癌（PCa）診斷的準确性，總靈敏度、特異性、陽性和陰性預測值均優于血清tPSA。uPM3分析尤其在血清PSA水準低時更有效。聯合uPM3與tPSA可提高檢出率，減少組織活檢。然而，準确性依賴于前列腺按摩的正确操作。改善DD3PCA3 RNA檢測可能進一步提高PCa檢出率，FDA已準許PCA3作為前列腺癌診斷标記物。
谷胱甘肽S轉移酶P1(glutathione-S-transferase P1，GSTPl):
異常甲基化與惡性良性腫瘤發展密切相關。正常細胞中，基因調控區CpG島非甲基化；癌變後，CG區域甲基化，可用于惡性良性腫瘤診斷。GSTPl基因突變與人類PCa發展相關，變異導緻超甲基化，使基因失活、抑癌活性喪失。測定GSTPl DNA甲基化水準可提高早期前列腺癌檢出率。研究顯示前列腺癌患者尿液中可檢測到超甲基化的GSTPl。
Goessl等的研究指出，通過甲基化特異性PCR（MSP）檢測尿液中的超甲基化GSTP1 DNA，可用于前列腺癌診斷。其特異性為98%，靈敏度為73%，優于血清PSA檢測。所有階段患者尿液中該名額水準無顯著差異。 Gonzalgo等收集前列腺穿刺後患者尿液，用MSP檢測超甲基化GSTP1 DNA水準。結果可将患者分為高風險和低風險組，指導是否需要活檢監測。這樣表達更簡潔明了。
“研究胸腺素β15等生物标志物以提高前列腺癌診斷。尿液檢測因其易收集、無創性或成新診斷途徑，但技術待簡化以便臨床應用。”
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前列腺癌症患者尿液樣本外泌體的分離與鑒定
奧斯陸大學癌症研究院Alicia Llorente團隊采用高通量測序，發現尿液中外泌體來源的miRNA可作為前列腺癌中度風險患者監控生物标志物，幫助區分惡性良性腫瘤風險等級并及時治療。結果發表在《British Journal of Cancer》。
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前列腺癌症患者尿液樣本外泌體的分離與鑒定
作者從70例前列腺癌患者尿液中提取外泌體，通過BCA和Qubit檢測蛋白質含量，用Western blot和納米流式分析其特征蛋白和粒徑。步驟：1. 提取外泌體：從前列腺癌患者的尿液樣本中通過差速離心擷取外泌體。2. 測定蛋白質含量：采用BCA分析和Qubit方法測量外泌體中的總蛋白量。3. 特征蛋白和粒徑檢測：使用Western blot技術檢測外泌體的特征蛋白，利用納米流式粒徑分析技術評估其粒徑。
圖1 外泌體特征性蛋白Western blot鑒定結果
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外泌體差異miRNA鑒定
接下來，作者對分離的外泌體miRNAs進行了測序，發現5個miRNA表達最豐富。利用這些miRNA建構ISUP分級預測模型并驗證，結果顯示前列腺癌患者尿液EVs中這些miRNA差異性顯著。
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RT-qPCR驗證分析
作者研究60例前列腺癌患者，驗證miR-186-5p、miR-320a-3p和miR-30e-5p表達差異。結合血清PSA值構模組化型，提高ISUP惡性良性腫瘤分級預測準确性。
圖2 前列腺癌患者尿液EV中鑒定的miRNAs在ISUP分級之間表現出差異表達模式
作者通過miRNA測序鑒定出區分ISUP分級1-3級前列腺癌的miRNAs，并通過RT-qPCR驗證了miR-186-5p、miR-320a-3p和miR-30e-5p在獨立隊列中的差異表達。尿液外泌體miRNAs顯示出作為前列腺癌生物标志物的潛力。結合PSA檢測，可提高中等風險患者風險等級區分的可靠性，為主動監測提供新方法。
前列腺癌在中國存在發病少、死亡多、初診疾病分期晚、發病率和死亡率呈現逐年上升趨勢的特點[1]，且《柳葉刀》前列腺癌重大報告中預測全球前列腺癌病例數将從2020年的240萬增加至2040年的290萬[2]。在此情況下，前列腺癌的早篩早診早治療對患者來講尤為重要，臨床也采取了許多前列腺癌早期診斷的技術手段為此服務。
圖1：中國2022年惡性良性腫瘤數量前十資料概覽[3]
尿液外泌體前列腺癌檢測産品
"《中國前列腺癌篩查指南2022》首選PSA篩查，但也面臨局限性。為提升準确性，研發了如“尿液外泌體前列腺癌檢測”等輔助診斷技術。該技術基于FDA認證的EPI檢測方法，通過檢測尿液外泌體資訊建立風險模型，專為PSA 4-20 ng/mL人群提供診療參考，減少不必要的活檢。"
圖2：尿液外泌體RNA前列腺癌檢測項目流程及适用人群
外泌體是直徑30-100納米、由多種細胞分泌的胞外囊泡，攜帶脂質、核酸、蛋白質等。這些囊泡在液體如尿液和血漿中廣泛分布，其特定内容物如miRNA、mRNA和lncRNA能反映原始細胞的病理狀态。是以，外泌體被視為疾病監測的潛在生物标志物。
圖3：外泌體的生物發生過程[6]
外泌體富集
自動化且穩定高效的外泌體富集純化，是外泌體在科研與臨床轉化中的關鍵環節，同時也是保證下遊實驗準确開展的基礎。為此，紐凱生物針對性開發出了全自動外泌體提取系統（EXODUS），并在《Nature Methods》作為封面文章發表該成果[7]。該系統将負壓振蕩系統(NPO)結合雙耦合諧波振蕩系統(HO)作用于納米超濾晶片，樣本中的遊離核酸與蛋白等雜質通過納米孔快速去除并截留外泌體，進而純化富集外泌體。該系統的有以下幾點優勢：
高速泌集（最高純化速度100 mL/h）；
純度和産量高，雜蛋白去除效率＞99%，回收率＞90%；
更少的樣本更高的産量，可支援微量、低濃度、稀有樣本；
不引入外源性雜質，外泌體形态完整、生物活性高、下遊應用廣。
圖4：全自動外泌體提取系統（EXODUS）
推出尿液外泌體RNA前列腺癌檢測，為4-20 ng/mL血清PSA人群提供風險評估，減少不必要的穿刺。
圖5：尿液外泌體前列腺癌檢測和PSA兩種篩查方法對臨床決策的結果差異
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