基因組編輯技術經曆了第一代鋅指核酸酶(zinc-finger nuclease，ZFNs)、第二代轉錄激活子樣效應因子核酸酶 (tran-scription activator-like effector nuclease，TALENs) 的發展，以及目前應用最廣泛、研究最深入的第三代規律性重複短回文序列簇(clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR / Cas) 系統。CRISPR/Cas 系統可以在動物、植物、微生物基因組上實作定點敲除、單堿基替換和插入、小片段精準插入和缺失等多種功能。但目前最廣泛使用的Cas9和Cas12a核酸酶的尺寸過大，以至于超過了很多載體的裝載量而難以遞送至細胞核。插入序列類似 Cas9 的 B蛋白(insertion sequences Cas9- like B，IscB)和轉座子相關轉座蛋白 B( transposon-associated transposase B，TnpB)等新型核酸酶，是 IS200 / IS605 轉座子超家族的成員，分别是Cas9和Cas12的祖先，兩者的大小均為約400個氨基酸，較小的體積使得它們在遞送到動植物細胞核上有較大的優勢，進而成為目前基因組編輯技術的研究熱點之一。
亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室、嶺南現代農業科學與技術廣東省實驗室、華南農業大學生命科學學院劉耀光院士和祝欽泷研究員團隊在《基因組學與應用生物學》期刊第42卷12期發表了題為“基因組編輯工具的發展：從CRISPR/Cas9 到 TnpB”的述評，對IscB 和 TnpB的系統進化關系、作用原理、最新研究進展進行綜述，以期為進行相關研究的人員提供幫助。
前言
從 DNA 雙螺旋結構發現以來，科學家們一直期望對生物體内的基因組進行修改和操控。從早期的寡核苷酸、小分子或自剪接内含子對 DNA 序列進行位點特異性識别，到利用蛋白質識别核苷酸序列的原理開發了位點定向的鋅指核酸酶(zinc-finger nuclease，ZFNs) 和轉錄激活子樣效應因子核酸酶 (transcription activator-like effector nuclease, TALENs)。在認識生命的微觀世界過程中，基于規律性重複短回文序列簇(clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR) 及其相關蛋白( CRISPR- associated protein，Cas) 的基因組編輯系統也經過了長期的發展。自 2013 年張鋒團隊首次将 CRISPR /Cas 應用在真核細胞基因組編輯中，生物學領域經曆了一場前所未有的革命。從此開啟了基因組編輯飛速發展的十年。在第一個十年，基于 CRISPR / Cas 開發的基因組編輯系統實作了在動物、植物、微生物基因組中定點敲除、單個或多個堿基替換、小片段精準插入和缺失等目标，在靶向、編輯、調節、修改、标記生物體内的基因組位點方面取得了巨大的進展。
對基因組編輯現有方法和新基因組編輯工具的總結，将更好地為基因組編輯技術和産業服務，促進基因組編輯更進一步發展。基因組編輯高速發展的第二個十年，将在臨床治療、農業育種和食品生産等不同行業進行更廣泛、更靈活的運用，并且在基因功能研究、基因組重程式設計、癌症以及其他遺傳疾病的治療方面持續發揮重要作用。
基因組編輯技術的簡要發展曆程
基因組編輯技術發展至今，主要經曆了三代不同的技術發展。第一代 ZFNs 基因組編輯系統，由可以識别特定堿基序列的鋅指蛋白和一個可切割雙鍊DNA 的核酸内切酶 Fok I組成, 其中, 鋅指蛋白可人工設計, 其中包含了對應識别多個不同的三個特異串聯連續堿基序列的鋅指結構；第二代 TALENs 基因組編輯系統，以Fok I核酸内切酶定向切割 DNA 雙鍊, 以轉錄激活因子樣效應因子(TALE)基序的組合排列形成的序列來識别單個堿基對；第三代CRISPR/Cas基因組編輯系統, 來源于細菌和古細菌對抗噬菌體外源 DNA 入侵的免疫應答反應，需要多個應答元件參與作用, 經過改造後成為目前簡潔的基因組編輯系統。其中應用最廣泛的是 CRISPR/Cas9系統，Cas9核酸内切酶能夠識别靶位點的原間隔鄰近基序序列(protospacer adjacent motif, PAM)，并在單導 RNA( single-guided RNA，sgRNA) 引導下與靶序列結合, 造成DNA 雙鍊斷裂(double-strand breaks, DSBs)。由于靶點設計與載體建構較簡單、編輯效率高以及能夠實作多靶點編輯等優點，CRISPR/Cas9編輯系統已成為在動植物和微生物上使用最廣泛、研究最深入的基因組編輯工具。在此基礎上, Cas9 還被進一步開發為 dCas9 ( dead Cas，無切割活性) 和 nCas9( nick Cas，單鍊缺刻) 等不同變體，用于轉錄激活/ 抑制、表觀遺傳修飾、堿基編輯以及引導編輯等多種類型的基因組編輯操作。
圖 1 CRISPR / Cas9 介導的基因組編輯原理
新型核酸酶/編輯工具的研究進展
CRISPR/Cas 基因組編輯工具也存在部分局限性，主要展現在PAM 序列固定導緻的靶向範圍的限制、效應因子的尺寸過大導緻的難以遞送以及靶向特異性導緻的脫靶等方面的問題。是以，科學家們在不同的細菌和古細菌中尋找到不同類型有基因組編輯能力的蛋白，以開發出多種多樣的編輯工具，打造全面靈活的基因組編輯工具包。按照系統進化關系和分類, CRISPR-Cas9 是一種Ⅱ類( Class Ⅱ) 中的Ⅱ型( Type Ⅱ) CRISPR-Cas 系統，被認為是從 IscB 蛋白進化而來；而轉座子相關轉座蛋白( transposon-associated transposase B, TnpB) 是一類來自 V 型的 CRISPR 系統, 被認為是 Cas12 蛋白的祖先。本文重點描述這兩種編輯工具最新研究進展及優化方式，以及其相較于 Cas9 和 Cas12 的特點與差別，并對其今後的應用方向進行展望。
圖 2 Type Ⅱ效應因子進化關系
圖 3 Type Ⅴ效應因子進化關系
圖 4 TnpB 與 Cas12f 蛋白結構域和 ωRNA 比較
展望
現有的關于 IscB 和 TnpB 的相關研究較少，集中于系統進化地位、切割活性驗證、ωRNA 元件必要性等方面， 并且應用該蛋白進行基因組編輯的直接範例較少。但是這兩種蛋白在大小上較 Cas9 具有很強的優勢，其編輯系統經過基于蛋白工程的優化後，較小的體積可以使病毒載體的遞送更簡單，對于基因組編輯治療疾病和動植物的基礎研究等方面具有獨特優越性。在動植物中，更小的編輯系統意味着載體建構和遞送更容易以及裝載量更大，這使得其應用範圍更加廣泛。但是IscB和TnpB也存在TAM 序列限制較大導緻的可編輯位點較少、在真核生物上編輯效率較 Cas9 和 Cas12a 更低等問題。是以，基于 IscB 和 TnpB 的新型基因組編輯系統有着廣泛的應用場景和極高的可提升空間，是未來基因組編輯工具的重點研發對象，在臨床醫療和農業育種中有重要的作用。
作者簡介
柴楠和劉雨馨為該文章的共同第一作者，劉耀光院士和祝欽泷研究員為該文章的共同通信作者。相關工作由國家重點研發計劃項目(2022YFF1002802) 和國家自然科學基金面上項目(32272120) 共同資助。
引用本文
柴楠，劉雨馨，張瑞祥，等，2023. 基因組編輯工具的發展：從 CRISPR / Cas9 到 TnpB. 基因組學與應用生物學，42 (12)：1267-1274. [ CHAI N, LIU Y X, ZHANG R X, et al., 2023. Development of genome editing tools: from CRISPR / Cas9 to TnpB. Genomics and Applied Biology, 42(12): 1267-1274.]
期刊簡介
《基因組學與應用生物學》是由廣西大學主管和主辦，國内外公開發行的科技期刊，為北京大學圖書館《中文核心期刊要目總覽》入編期刊、中國科學引文資料庫（CSCD）來源期刊、科技期刊世界影響力指數（WJCI)報告來源期刊和中國科技核心期刊（中國科技論文統計源期刊）。本刊主要刊登植物、動物和微生物基因組學、轉錄組學、蛋白組學和代謝組學等組學，分子醫學、現代生物技術等應用生物學研究的未發表的創新性研究成果，以及上述領域的綜述論文。本刊“‘騰雲’期刊協同采編系統（知網版）”已面向作者、同行專家、編輯人員正式開放，全面投入使用，本刊隻接受通信作者通過上述系統的投稿，不再接收電子郵箱和紙質等其它形式的投稿，并隻和一位通信作者聯系，謝謝合作。
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