大家好，今天為大家帶來的文章是2024年5月15日發表在Journal of Agricultural and Food Chemistry上的“Engineering a Carotenoid Cleavage Oxygenase for Coenzyme-Free Synthesis of Vanillin from Ferulic Acid”，通訊作者是陝西師範大學食品學院的孟永宏老師。
阿魏酸一鍋生物合成香蘭素無需提供能量和輔助因子，為木質素廢物流增加了顯著的價值。然而，自然進化的類胡蘿蔔素裂解加氧酶(CCO)具有極端的堿性環境下的催化加氧條件，極大地限制了上述途徑的香蘭素生物生産。本文對嗜熱熱熱菌(TtCCO)的CCO進行了合理設計，使其在中性pH條件下具有較高的催化活性，并進一步利用TtCCO與矮芽孢杆菌阿魏酸脫羧酶建構了一鍋法合成香蘭素的體系。通過襯底接入通道工程、催化口袋工程和口袋電荷工程，逐漸獲得了K192N-V310G-A311T-R404N-D407FN556A突變(TtCCOM3)的TtCCO。分子動力學模拟結果表明，TtCCOM3在中性pH條件下具有較高的催化活性，降低了底物通道中的位點阻斷效應，增強了催化口袋中底物的親和力，消除了口袋中的堿性電荷。最後，本研究中香蘭素的一鍋合成速率最高可達6.89±0.3 mM/h。是以，作者的研究為将可再生木質素相關芳烴轉化為有價值的化學品的一鍋生物合成工藝鋪平了道路。
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- 1. DLkcat對FDCs和CCOs的預篩選和表征
作者使用FDC (AJ278683.1)和CCO (WP013080875.1)作為查詢序列，并從國家生物技術資訊中心資料庫中為輔酶a獨立途徑中的兩個催化組分各選擇了8個替代酶(表1)。建構系統發生樹進行聚類分析，進一步闡明進化關系(圖1b)。結果表明，FDC主要來源于曲黴和芽孢杆菌兩種微生物，CCO系統發育樹包含三個類:γ-變形菌門、熱微生物門和α-變形菌門。随後，作者使用深度學習技術預測酶周轉數(DLkcat)，用于預篩選蛋白質(表1)。在候選蛋白中，葡曲黴(Aspergillus luchuensis) FDC (AlFDC)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) FDC (BlFDC)和BpFDC将FA轉化為4-VP的kcat值最高。Caulobacter segnis CCO (CsCCO)、TtCCO和Serratia sp. CCO (SsCCO)具有将4-VP轉化為香蘭素的高kcat值。是以，作者對這6種酶進行了表達，用于後續實驗。
圖1
表1
作者首先确定了BpFDC、AlFDC和BlFDC的酶促性質。BpFDC、AlFDC和BlFDC的轉化率分别為89.7、74.7和81.6%。BpFDC、AlFDC和BlFDC的最佳催化溫度/pH分别為30°C/pH = 7、20°C/pH = 5和30°C/pH = 5(圖1c,d)。測定了三種FDCs的酶動力學參數。BpFDC表現出最高的催化效率(kcat/Km)，分别是AlFDC和BlFDC的4.24倍和3.84倍(表2)。是以，BpFDC被認為是最适合在不依賴CoA途徑中合成香蘭素的生物催化劑。随後，作者測定了CsCCO、TtCCO和SsCCO的酶學性質和動力學參數。他們的轉化率分别為23.2%、48.1%和25.3%。上述三種CCOs的最佳催化pH和溫度均為pH 9和30℃(圖1c,d)。TtCCO的催化效率值(kcat/ Km)為19.11 /min/mM，約為CsCCO和SsCCO的3−4倍(表2)。是以，TtCCO也被認為是高效合成香蘭素的有前景的催化劑。BpFDC和TtCCO的最佳催化溫度均為30℃，最佳催化pH值不同。TtCCO的強堿性催化條件限制了一鍋綠色合成。此外，TtCCO的催化效率值(kcat/Km) (19.11 /min/mM)顯著低于BpFDC (179.13 /min /mM)，這限制了香蘭素的生産。
表2
- 2.TtCCO的底物通道工程
重塑TtCCO的底物通道可以使4-VP更容易進入催化袋。是以，以類胡蘿蔔素加氧酶1 (PDB ID: 7T8P)為模闆，通過AlphaFold2建構TtCCO結構，并進一步與4-VP對接。使用caver script33(圖2)，作者預測4-VP通過狹窄的通道進入催化口袋中與Fe2+結合的活性中心。WT-TtCCO的底物入口通道由20個殘基(N145, V147, F148, H190, P191, K192, I193, M200, R404, I405, D407, V410, E497, H554, G555, N556, W557, A189, V310和S403)構成。作者注意到Debye - Waller因子(b因子)提供了對蛋白質内部原子，殘基側鍊和環區遷移性和靈活性的基礎，利用TtCCO與4-VP在100ns内的對接結果進行分子動力學(MD)模拟。選擇RMSF波動小于0.05 nm的殘基來增強襯底通道的柔韌性。随後，具有粗大側鍊的殘基(N145、F148、S403、N556和W557)突變為側鍊較短的殘基，如丙氨酸、缬氨酸和甘氨酸。N145A、S403A和N556A-TtCCO變體在全細胞催化下表現出更高的轉化率。進一步的酶動力學分析表明，突變體N556ATtCCO的催化效率最高，為57.19 /min/mM，是WT-TtCCO的2.99倍(表3)。突變體N145A和S403A的催化效率分别為33.14和25.69 /min/ mM(表3)。随後，作者将上述單點突變位點合并進行疊代誘變，并分别分析其純化酶的酶動力學(表3)。第二次疊代TtCCO變體和更高疊代TtCCO變體的相對酶活性均不高于N556A-TtCCO變體。雙突變體N145A-S403A、N145A-N556A和S403A-N556A的催化效率分别為35.89、33.16和29.93 /min/mM(表3)。同時，三突變體N145A-S403A-N556A的催化效率為35.24 /min/mM(表3)。是以，選擇N556A-TtCCO (TtCCOM1)作為後續酶工程的最佳模闆。
圖2
表3
3.TtCCO催化袋的工程設計
TtCCO的催化中心由Fe2+與H190、H244、H309和H554配位形成。TtCCO利用Fe2+4 × His催化中心和氧氣分子促進烯烴雙鍵裂解生成醛。氧分子附着在非血紅素亞鐵中心形成超氧化物結構域。Fe2+結合的氧原子靠近烯基自由基，與底物形成兩個C−O鍵。随後，Fe2+結合的含氧中間體中的電子重排促進了C - C鍵的裂解，生成香蘭素和小分子甲醛。催化口袋中的殘基起到調節構象的作用，引入氧分子，并提供電子促進催化反應。TtCCOM1和4-VP配合物的MD模拟(100 ns)表明，D407、V310和A311有助于與4-VP靠近Fe2+中心的乙烯基互相作用(圖3)。D407、V310和A311通過位點飽和誘變建構了機關點突變文庫。D407F-TtCCOM1、V310G-TtCCOM1和A311T-TtCCOM1的轉化率更高，分别為81.4、82.2和80.1%(表3)。進一步測定單點突變體的酶動力學參數。D407F-TtCCOM1、V310G-TtCCOM1和A311T-TtCCOM1的催化效率分别為70.94、72.08和64.45 /min/mM(表3)。随後，進行疊代誘變以産生三重和四重突變體。最終得到D407F/A311T/V310GTtCCOM1 (TtCCOM2)，提高了催化效率。TtCCOM2的催化效率為90.36 /min/mM，是WT-TtCCO (19.11 /min/mM)的4.73倍。
圖3
- 4.工程TtCCO的口袋電荷在中性條件下的高效催化
改變酶的催化口袋内的電荷可以調節酶的催化pH，是以，作者試圖通過改變催化凹槽的内部電荷環境來實作綠色催化。為了清晰地描述酶袋的表面電荷梯度，作者繪制了描繪TtCCOM2表面電荷的電位圖。6 Å中的關鍵殘基Asp192和Arg404被确定為TtCCOM2催化pH的潛在關鍵(圖4a)。TtCCOM2的單點突變體K192N和R404N的轉化率分别達到了86.6和87.3%(表3)。它們的最優pH值已擴大到中性範圍，4-VP的消耗率基本保持不變。作者使用疊代方法尋找中性和有效的突變體，并鑒定了突變體K192N/R404N-TtCCOM2 (TtCCOM3)。TtCCOM3的催化效率是野生型的6.71倍。該催化劑在pH值為7 ~ 9的範圍内保持相當大的活性(圖4b)。
圖4
5.TtCCO突變體催化4-VP氧化的分子模拟
作者通過分子對接和MD模拟，對TtCCOM3活性增強的機制進行了結構分析和計算分析。首先，通過底物接入通道工程獲得N556A突變的TtCCOM1與WTTtCCO相比，底物接入通道由s形修改為l形，主要由N556A引起(圖5a,b)。
圖5
作者進一步分析了TtCCOM1(0.55)和WT-TtCCO(0.39)的平均底物吞吐量。556位殘基的取代加快了底物轉移效率。作者還使用MD模拟分析了WT-TtCCO和TtCCOM1中每個殘基在100 ns下的b因子值。N556A周圍區域的均方根波動(b因子)值相對較高，顯示出比WTTtCCO更大的靈活性。增加的柔韌性促進了4-VP自由基在底物通路中的運動，進而增加了4-VP與TtCCO活性中心結合的速率。
TtCCO底物口袋的改造涉及空間結構改變和電荷修飾，電荷修飾也為4-VP帶來了新的分子間作用力。是以，作者利用分子對接和MD模拟來分析TtCCOM3 (K192N−V310G-A331T-R404N-D407F-TtCCOM1)和底物配合物。首先，在100 ns内測量了蛋白質-底物複合物中C8 - C9 - Fe2+的角度和C9到Fe2+的距離(圖5c)。C8−C9−Fe2+的夾角為60°，野生型C9到Fe2的距離為5±0.5 Å。在TtCCOM3突變體中，4-VP的氧化乙烯基垂直暴露于Fe2+催化中心，4-VP的乙烯基與Fe2+催化中心之間的距離為3.8±0.2 Å。作者還測量了突變前後殘基的能量分解。N192、T311和N404與4-VP形成的新互相作用能分别為15.8、34.9和8.9 kJ/mol(圖5d)。F407與4-VP形成24.3 kJ/mol的強排斥力，壓縮了催化袋内4-VP的構象，使其更靠近Fe2+催化中心(從5±0.5變為3.8±0.2 Å)(圖5c,d)。在突變體中發現了與4-VP結合的明顯構象變化(圖5e,f)。TtCCOM3和4-VP的556和310位點的平均距離分别為4.9和6.6 Å，野生型的平均距離分别為3.6和2.2 Å。增加的平均距離可以減小空間障礙。TtCCOM3在D407F/V310G/ A311T中的極性升高促進了4-VP與Fe2+催化中心之間的電子轉移。H190與4-VP的苯環中心形成了π-陽離子鍵，與4-VP的苯乙烯基形成了π-烷基互相作用。H309和H554與4-VP的苯乙烯基團産生π-烷基疏水互相作用(圖5g,h)。與苯乙烯基團的疏水互相作用增強，促進了電子向烯烴的轉移，促進了TtCCOM3識别和錨定4-VP，提高了TtCCO的催化活性。
TtCCOM3的N145和D245與4-OH形成新的氫鍵，并與中心雙鍵共轭(圖6)，極性殘基D245攻擊烯烴在4-VP的羟基對面。鐵(III)超氧化物自由基發起親核攻擊，将一個氧原子插入碳原子。D245和N145對4-OH基團的激活作用導緻電子雲向中心雙鍵和Fe (III)超氧化物區域移動。氫鍵和其他分子間作用力增強了中間自由基的穩定性，促進了C−O鍵的形成和O−O鍵的裂解。
圖6
6.中性條件下由輔酶依賴途徑驅動的香蘭素一鍋生物合成
作者将BpFDC與TtCCOM3結合得到了中性高效的催化劑。随後，建構pETDuet-BpFDC-TtCCO和pETDuet-BpFDC-TtCCOM3，并在大腸杆菌BL21(DE3)中表達，在一鍋中生産香蘭素。在30°C和pH 7下發酵12 h，測量香蘭素産量(圖7a,b)。結果表明，pETDuet-BpFDC-TtCCOM3基團的摩爾轉化率為98%。新型大腸杆菌催化體系的最大産率為6.89±0.3 mM/h，約為pETDuet-BpFDC-TtCCO基團的6.15倍。是以，酶工程實作了更高效的香蘭素合成。
圖7