大家好，今天推送的文章是2024年4月發表在Angewandte Chemie 上的“Peroxygenase-Enabled Reductive Kinetic Resolution for the Enantioenrichment of Organoperoxides”，通訊作者為中國科學院天津工業生物技術研究所的張武元研究員。
過氧天然産物（青蒿素、蒿甲醚和鷹爪素C等）具有高效的抗癌、抗惡性良性腫瘤和抗瘧疾功能。近年來，手性純有機過氧化物的制備一直是不對稱合成領域的研究熱點，然而很難通過傳統的化學方法獲得光學純度高的過氧化物。酶催化反應由于其具有的溫和催化條件、化學選擇性、區域選擇性和立體選擇性，已經成為過去幾十年來有機合成領域的一個重點研究方向。盡管部分酶已被證明是制備光學活性氫過氧化物的有效催化劑，但其底物範圍有限，酶種類少，且由于有機過氧化物的存在而不穩定。
非特異性過氧化物酶AaeUPO已被證明是各種氧化反應的有前途的催化劑。過氧化物酶與P450單加氧酶具有相同的瞬态鐵(IV)-氧代卟啉自由基陽離子（化合物I）作為活性物質，是以過氧化物酶的反應性仍未得到充分探索。目前，過氧化物酶已被證明可以催化C-H氧化功能化、C=C鍵環氧化、N-氧化和S-氧化以及去芳構化(方案1A)，但作為手性催化劑，過氧化物酶尚未被用于動力學拆分反應。
在這項研究中，作者首次證明了非特異性過氧化物酶可以催化外消旋有機過氧化物的還原動力學分解，以産生光學純的有機過氧化物(方案1B)。為了擴大産品範圍，作者還探索了一系列過氧化物酶來獲得具有互補手性的目标産品。這項工作不僅擴大了反應範圍，而且為不對稱合成和富集手性有機過氧化物提供了新途徑。
圖1
作者首先研究了過氧化物酶動力學分解有機過氧化物的适用性。以苯丙類過氧化氫(1)作為模型反應(圖1)，觀察到了rac-1的連續分辨率(圖1A)，rac-1的動力學拆分反應可以同時以89%的手性選擇性得到相應的(R)-苯丙醇。
進一步對底物濃度的實驗表明，AaeUPO可以耐受30 mM的有機過氧化物，其周轉數為60000，周轉頻率為5.6 s-1，進一步增加底物負載可能會導緻血紅素輔基的氧化破壞(圖1B)。pH測試實驗表明，AaeUPO可以在4.0~10.0的較寬pH範圍内催化還原反應，最佳pH集中在6.0~8.0之間，達到最大轉化率(圖1C)。
作者還發現AaeUPO催化有機過氧化物動力學分解的手性選擇性與犧牲劑的濃度有關。沒有犧牲劑時，産物的手性選擇性僅為13%。增加愈木酚犧牲劑的濃度，其轉化率逐漸提高到50%，手性選擇性大于99%(圖1D)。愈創木酚與底物等量時已經完全溶解外消旋有機過氧化物，表明愈創木酚被多次氧化。分子對接表明愈創木酚定位在血紅素中心附近，有利于愈創木酚氧化。作者分析認為，愈創木酚經曆了多步氧化過程，使其成為有效的電子供體。其他犧牲劑電子供體(MeOH, EtOH, TEA和EDTA-2Na)的效率均低于愈創木酚。
接下來作者測定了底物1還原的動力學參數Km和kcat。高Km值(Km=4.6 mM)可能是由于有機過氧化物在緩沖條件下的溶解度較差，kcat=1424 s-1表明在所研究的動力學拆分反應中過氧化物酶的轉化非常有效。
圖2
在掌握了反應條件後，作者繼續研究該酶可以接受的有機過氧化物的範圍(圖2)。結果表明，芳香族化合物上大多數取代基的存在對酶的手性選擇性沒有顯著影響，而烷基取代基進一步增加或烷基的分支會對AaeUPO動力學拆分中的手性選擇性産生重大影響。
制備反應中存在起始底物、分解産物和電子供體及多重氧化産物的混合體系，但作者實驗證明了二氧化矽柱足以分離所有化合物并最終産生所需的手性有機過氧化物。
圖3
最後，作者篩選了大量的非特異性過氧化物酶（圖3），找到了一個可以成功逆轉産物構型的過氧化物酶(UPO 3.2)，盡管其手性選擇性并不出色。對UPO 3.2的底物範圍進一步調查顯示，4種産物為(R)-構型，ee值範圍為9%-28%(表1)。
表1
圖2
本研究證明了非特異性過氧化物酶催化和富集手性有機過氧化物的還原動力學拆分反應的能力。雖然野生型過氧化物酶主要表現出(R)-有機過氧化物的合成活性，但篩選出了商業酶變體UPO 3.2表現出(S)-選擇性，表明通過蛋白質工程等手段可以調節立體選擇性。除了為制備具有光學活性的有機過氧化物提供了一種有前途的生物催化方法外本研究還擴充了過氧化物酶催化的有價化合物的不對稱合成的反應範圍。