大家好，今天推送的文章是2024年4月发表在Angewandte Chemie 上的“Peroxygenase-Enabled Reductive Kinetic Resolution for the Enantioenrichment of Organoperoxides”，通讯作者为中国科学院天津工业生物技术研究所的张武元研究员。
过氧天然产物（青蒿素、蒿甲醚和鹰爪素C等）具有高效的抗癌、抗肿瘤和抗疟疾功能。近年来，手性纯有机过氧化物的制备一直是不对称合成领域的研究热点，然而很难通过传统的化学方法获得光学纯度高的过氧化物。酶催化反应由于其具有的温和催化条件、化学选择性、区域选择性和立体选择性，已经成为过去几十年来有机合成领域的一个重点研究方向。尽管部分酶已被证明是制备光学活性氢过氧化物的有效催化剂，但其底物范围有限，酶种类少，且由于有机过氧化物的存在而不稳定。
非特异性过氧化物酶AaeUPO已被证明是各种氧化反应的有前途的催化剂。过氧化物酶与P450单加氧酶具有相同的瞬态铁(IV)-氧代卟啉自由基阳离子（化合物I）作为活性物质，因此过氧化物酶的反应性仍未得到充分探索。目前，过氧化物酶已被证明可以催化C-H氧化功能化、C=C键环氧化、N-氧化和S-氧化以及去芳构化(方案1A)，但作为手性催化剂，过氧化物酶尚未被用于动力学拆分反应。
在这项研究中，作者首次证明了非特异性过氧化物酶可以催化外消旋有机过氧化物的还原动力学分解，以产生光学纯的有机过氧化物(方案1B)。为了扩大产品范围，作者还探索了一系列过氧化物酶来获得具有互补手性的目标产品。这项工作不仅扩大了反应范围，而且为不对称合成和富集手性有机过氧化物提供了新途径。
图1
作者首先研究了过氧化物酶动力学分解有机过氧化物的适用性。以苯丙类过氧化氢(1)作为模型反应(图1)，观察到了rac-1的连续分辨率(图1A)，rac-1的动力学拆分反应可以同时以89%的手性选择性得到相应的(R)-苯丙醇。
进一步对底物浓度的实验表明，AaeUPO可以耐受30 mM的有机过氧化物，其周转数为60000，周转频率为5.6 s-1，进一步增加底物负载可能会导致血红素辅基的氧化破坏(图1B)。pH测试实验表明，AaeUPO可以在4.0~10.0的较宽pH范围内催化还原反应，最佳pH集中在6.0~8.0之间，达到最大转化率(图1C)。
作者还发现AaeUPO催化有机过氧化物动力学分解的手性选择性与牺牲剂的浓度有关。没有牺牲剂时，产物的手性选择性仅为13%。增加愈木酚牺牲剂的浓度，其转化率逐渐提高到50%，手性选择性大于99%(图1D)。愈创木酚与底物等量时已经完全溶解外消旋有机过氧化物，表明愈创木酚被多次氧化。分子对接表明愈创木酚定位在血红素中心附近，有利于愈创木酚氧化。作者分析认为，愈创木酚经历了多步氧化过程，使其成为有效的电子供体。其他牺牲剂电子供体(MeOH, EtOH, TEA和EDTA-2Na)的效率均低于愈创木酚。
接下来作者测定了底物1还原的动力学参数Km和kcat。高Km值(Km=4.6 mM)可能是由于有机过氧化物在缓冲条件下的溶解度较差，kcat=1424 s-1表明在所研究的动力学拆分反应中过氧化物酶的转化非常有效。
图2
在掌握了反应条件后，作者继续研究该酶可以接受的有机过氧化物的范围(图2)。结果表明，芳香族化合物上大多数取代基的存在对酶的手性选择性没有显著影响，而烷基取代基进一步增加或烷基的分支会对AaeUPO动力学拆分中的手性选择性产生重大影响。
制备反应中存在起始底物、分解产物和电子供体及多重氧化产物的混合体系，但作者实验证明了二氧化硅柱足以分离所有化合物并最终产生所需的手性有机过氧化物。
图3
最后，作者筛选了大量的非特异性过氧化物酶（图3），找到了一个可以成功逆转产物构型的过氧化物酶(UPO 3.2)，尽管其手性选择性并不出色。对UPO 3.2的底物范围进一步调查显示，4种产物为(R)-构型，ee值范围为9%-28%(表1)。
表1
图2
本研究证明了非特异性过氧化物酶催化和富集手性有机过氧化物的还原动力学拆分反应的能力。虽然野生型过氧化物酶主要表现出(R)-有机过氧化物的合成活性，但筛选出了商业酶变体UPO 3.2表现出(S)-选择性，表明通过蛋白质工程等手段可以调节立体选择性。除了为制备具有光学活性的有机过氧化物提供了一种有前途的生物催化方法外本研究还扩展了过氧化物酶催化的有价化合物的不对称合成的反应范围。