作者：柯荟 範琳
機關：同濟大學附屬上海市肺科醫院結核科 上海市感染性疾病（結核病）醫學臨床研究中心 上海市結核（肺）重點實驗室
引用本文: 柯荟, 範琳. 結核病免疫治療年度進展2023 [J] . 中華結核和呼吸雜志, 2024, 47(4) : 371-375. DOI: 10.3760/cma.j.cn112147-20231031-00283.
摘要
結核病作為一種慢性感染性疾病，與免疫調控及免疫效應密切相關。免疫治療作為結核病綜合治療的重要手段之一，可改善結核病的療效、控制結核病的傳播。2022年10月至2023年9月，國内外進行了多項關于結核病的免疫治療研究，對耐多藥、廣泛耐藥結核的治療提供了新的可能。宿主靶向治療及治療性疫苗的研究是結核病輔助治療探索的新方向。
由結核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的結核病仍然是導緻傳染病死亡的主要原因。盡管近年來，結核病的診斷、治療和疫苗研發方面取得了一定的進展，但全球的結核病疫情仍然不容樂觀，根據世界衛生組織釋出的《2023年全球結核病報告》，2022年全球估算結核病發病數為1 060萬例，死亡130萬例，耐多藥/利福平耐藥結核病（MDR/RR-TB）病例41萬例［1］。結核病是慢性感染性疾病，疾病的發病及進展與宿主的免疫狀态密切相關，免疫治療是結核病治療的重要方法之一，結核病可通過免疫治療調節機體的免疫效應，以達到加快痰菌轉陰、提高治療成功率、縮短療程的目的。本文拟将2022年10月至2023年9月結核病免疫治療研究的進展，從細胞實驗、動物實驗、臨床研究三個層面進行綜述。
一、細胞實驗相關研究
宿主導向治療是近年來結核病免疫治療的主要政策之一，該政策将抗菌的治療方向轉為針對宿主的靶細胞、靶蛋白，通過小分子調控宿主的免疫功能，包括老藥新用、營養制劑、單克隆抗體、免疫調節劑等，通過調節宿主的免疫功能達到免疫治療的目的［2］。MTB有多種抗原通過各種模式識别受體與宿主細胞發生作用，其中Toll樣受體（TLR）2和4是兩種主要的模式識别受體，不同的MTB配體激活TLR2/4受體，通過激活下遊信号級聯拮抗或激動的方式改變宿主免疫反應［3］。了解免疫網絡之間的信号網絡和交叉對話對于開發針對MTB的宿主定向免疫政策非常重要。确定結核病免疫治療的宿主靶向靶點和免疫反應分子标志物是迫切而有意義的。既往研究已證明自噬在結核病的感染過程和感染後發病過程中都起着重要作用，并與結核病治療的預後有關。細胞因子治療和細胞因子介導的自噬已被用作主要的宿主導向治療方法來抑制MTB在宿主細胞中的生長。Mishra等［4］研究了大豆凝集素（SBL）通過細胞因子介導的自噬誘導分化的THP-1（dTHP-1）細胞的抗結核活性。在SBL治療後，已感染MTB的dTHP-1細胞通過P2X配體門控離子通道7受體（purinergic receptor P2X，ligand-gated ion channel 7，P2RX7）介導的途徑，白細胞介素（IL）-6的表達顯著增加。SBL與P2RX7互相作用調節PI3K/Akt/CREB網絡，促進dTHP-1細胞分泌釋放IL-6，IL-6反過來可激活JAK2/STAT3/Mcl-1途徑，通過與IL-6Rα互相作用來調節自噬，最終控制巨噬細胞中的MTB的生長。另外，Xiao等［5］研究發現蘿蔔硫素（SFN）通過增強THP-1細胞的自噬來降低細胞内的細菌負荷，研究顯示自噬相關基因與結核病的免疫浸潤相關，SFN可調控自噬相關的三個關鍵基因，尤其是自噬相關基因FOXO1，後者将為臨床結核病的診斷和免疫治療政策提供新的靶标。由于MTB感染宿主後主要持留于巨噬細胞中，是以将抗結核藥物靶向作用于巨噬細胞可有助于提高抗結核效果。磷脂酰絲氨酸（PS）是一種生物膜磷脂，常存在于細胞膜内側。細胞凋亡時，PS可以從細胞膜内側翻轉到細胞膜表面，顯示出特異性的“eat-me”信号，被巨噬細胞上的特異性受體所識别。Tian等［6］利用PS的這種巨噬細胞靶向特性建構了PCN-CpG@PS納米複合材料，形成靶向給藥系統。在這項研究中。CpG寡脫氧核苷酸（CpG oligodeoxynucleotides，CpG ODNs）是人工合成的寡脫氧核糖核苷酸序列，可通過刺激哺乳動物免疫細胞中的TLR來誘導Th1型免疫反應殺死MTB。然而，由于CpG ODNs的負電荷和易降解的特征，需要使用納米材料将其輸送到細胞中。PCN-CpG@PS旨在靶向病變部位的巨噬細胞并殺死潛伏在胞内的MTB，研究表明該靶向納米複合材料具有一定的體外抗結核效果及良好的安全性。Kumari等［7］在另一項研究中探索了醉茄素A（withaferin A，WA）作為結核病免疫治療藥物的作用，研究提示WA可通過增強宿主的免疫反應來抑制細胞記憶體活的MTB，還可引導宿主的巨噬細胞向防禦性M1極化方向轉化，增強宿主對MTB感染的Th1和Th17型免疫反應。提示WA可作為一種有效的輔助免疫調節劑，通過促進STAT信号傳導增強宿主保護性記憶細胞的功能，進而提高宿主對MTB的防禦能力。
二、動物實驗相關研究
1.以谷氨酰胺代謝拮抗劑JHU083為靶點治療：MTB已經進化出一系列不同的決定因素來破壞宿主免疫并改變宿主代謝模式。然而，研究病原體幹擾宿主的代謝機制仍然知之甚少。Parveen等［8］研究證明了一種新的谷氨酰胺代謝拮抗劑JHU083在體外及體内均可抑制MTB的增殖，表現在JHU083治療下小鼠的體重增加、存活率提高，感染後35 d肺部細菌負荷降低2.5 log，肺部病理損傷減輕。與未感染和利福平治療的對照組相比，JHU083治療可更早地啟動T細胞募集、增加促炎髓樣細胞浸潤、減少抑制性髓樣細胞的聚集。經JHU083治療的MTB感染小鼠，将其肺部組織進行代謝組學分析結果顯示谷氨酰胺水準降低、瓜氨酸積累、一氧化氮（NO）合酶活性升高，同時喹啉酸（為免疫抑制代謝物犬尿氨酸所産生）水準降低。JHU083處理的巨噬細胞則可産生更多的NO，增強巨噬細胞的抗菌活性。在免疫功能低下的MTB感染的小鼠模型中進行測試時，發現JHU083治療效果降低，表明該藥物作用下引起的宿主導向的免疫調節作用在療效中占主導地位。是以，JHU083作為谷氨酰胺代謝拮抗劑對MTB具有免疫調節和抗菌的雙重作用，具有有效的宿主導向抗結核活性。2. 以蛋白酶為靶點治療：宿主細胞的組織蛋白酶可以調控MTB、降低巨噬細胞的蛋白水解活性，進而提高病原體的存活率，是很有潛力的治療靶點。Mandal等［9］研究提示酶蛋白抑制劑胱抑素F在MTB感染期間在宿主細胞中表達明顯增多。使用siRNA沉默胱抑素F可以提高組織蛋白酶S、L、B的蛋白水解活性，顯著影響巨噬細胞内病原體的殺傷力，提示胱抑素F可作為結核病尤其是耐多藥和廣泛耐藥結核病潛在的免疫治療手段。另外，在MTB中，酪蛋白溶解蛋白酶P（ClpP）蛋白水解後包括ClpP1、ClpP2、AAA1伴侶蛋白，其中ClpP及其AAA1伴侶可維持MTB細胞中的蛋白穩态，對細菌生存至關重要，是重要的生物學靶點之一［10］，具有開發治療耐多藥結核病新藥的潛能。在過去的10年裡，許多靶向MTB ClpP1P2的調節劑已被鑒定和表征，其中一些已顯示出有效的抗結核活性［10］。3.Vγ2Vδ2 T細胞免疫治療：既往研究提示磷酸抗原特異性Vγ2Vδ2 T細胞在結核病免疫中可發揮保護作用。增強保護性Vγ2Vδ2 效應T細胞可改善MDR-TB患者的治療效果。Shen等［11］使用臨床準許的藥物唑來膦酸鈉（ZOL）和白細胞介素2（IL-2）誘導具有抗結核作用的Vγ2Vδ2效應T細胞，作為感染MDR-TB菌株的猕猴的輔助免疫治療。研究提示給感染MDR-TB菌株的猕猴使用ZOL/IL-2作為化學治療的輔助治療，可顯著擴增Vγ2Vδ2 T細胞，增強并維持Vγ2Vδ2 效應T細胞亞群分泌保護性細胞因子，且效應可維持至用藥後的第21周。ZOL/IL-2在增加Vγ2Vδ2 T細胞數量的同時，還能顯著增加并維持血循環中CD4+Th1和CD8+Th1樣效應細胞的數量，在MDR-TB感染後的第3周，γδ T細胞或αβ效應T細胞可遷移到氣道，效應維持到第19或21周。研究結果表明與對照組比較，輔助使用ZOL/IL-2可顯著降低宿主肺部的細菌負荷，減輕耐多藥結核病宿主體内的病理損傷。由此可見，唑來膦酸鈉聯合IL-2可提高具有抗結核作用的Vγ2vδ2 T細胞和αβ效應T細胞的數量，進而提高MDR-TB的治療效果。4. 間充質幹細胞免疫治療：間充質幹細胞（mesenchymal stem cells，MSC）具有多種功能，包括再生、促進傷口愈合、調節免疫信号等。這些多功能幹細胞在調節免疫系統的各個方面也起着至關重要的作用，MTB可感染間充質幹細胞并躲避免疫系統對其的消滅，已有研究表明間充質幹細胞可作為結核病的輔助療法。Chenari等［12］通過感染卡介苗（BCG）建立BALB/c小鼠肺發炎模型，探讨鼻腔給予MSC上清液的治療作用。研究從小鼠脂肪組織中分離出間充質幹細胞，第三代傳代後，收集細胞培養液。結果提示感染卡介苗組的小鼠，在給予補充間充質幹細胞後，小鼠的肺泡灌洗液中TNF-α/IL-10比值明顯下降，研究提示MSC治療可減少肺組織的損傷、誘導有效的免疫保護應答。5.治療性疫苗：傳統的卡介苗接種是皮内注射，通過另一種途徑提供卡介苗可能會增強保護的深度和廣度。Kurtz等［13］利用多樣性外交雜（DO）小鼠來檢測卡介苗通過靜脈注射給藥時誘導的保護作用。研究發現與皮下接種疫苗的小鼠相比，靜脈注射接種的DO小鼠在其整個器官中有更大的卡介苗分布，但小鼠肺和脾髒的MTB負擔沒有顯著減少，肺部發炎也沒有顯著改變。盡管如此，靜脈注射卡介苗的DO小鼠比通過傳統途徑接種的小鼠存活率更高，并在不同的小動物模型中檢測到，靜脈注射途徑遞送卡介苗可以增強保護作用。MTB Ag85A和Ag85B蛋白是宿主先天免疫細胞早期識别的分泌蛋白和抗原，具有良好的免疫原性。既往研究開發了ag85a/b嵌合DNA疫苗通過肌内注射（IM）和電穿孔（EP）接種在MTB小鼠模型中可以誘導顯著的Th1和CTL細胞免疫反應，但是這兩種疫苗免疫方法之間的作用機制尚不清楚。Wang等［14］研究提示MTB小鼠大部分上調的差異基因與營養物質的消化吸收或神經内分泌有關，而大部分下調的差異基因與細胞結構和功能蛋白有關，尤其是肺泡上皮細胞的結構和功能蛋白。在Ag85a/b DNA IM組及EP組中，大部分異常上調或下調的差異基因得到恢複。研究提示MTB感染引起小鼠分解代謝加快，合成代謝減慢，無論是肌肉注射還是電穿孔免疫有效劑量的ag85a/b DNA疫苗均能顯著上調免疫相關通路，恢複MTB引起的代謝紊亂和損傷。新型多組分疫苗将多種免疫優勢抗原結合，形成具有廣譜抗原的疫苗，誘導保護性免疫應答是結核病疫苗發展的趨勢。Wang等［15］ 利用T細胞富含表位的蛋白亞基建構了三個抗原組合：EPC002、ECA006、EPCP009。純化蛋白EPC002f、ECA006f、EPCP009f和重組純化蛋白混合物EPC002m（CFP-10、ESAT-6和nPPE18的混合物）、ECA006m（CFP-10、ESAT-6和Ag85B的混合物）和EPCP009m（CFP-10、ESAT-6、nPPE18和nPstS1的混合物）作為抗原，用明膠佐劑配制。通過BALB/c小鼠免疫實驗，分析其免疫原性和療效。體外MTB生長抑制實驗表明，EPCP009m對MTB生長的抑制作用最強，顯著優于其他4種候選疫苗。含有4種免疫優勢抗原的EPCP009m在體外具有較好的免疫原性和抑制MTB生長的能力，可能是一種有前景的結核控制候選疫苗。另外，Yu等［16］選擇ESAT-6、CFP-10、兩個全長抗原和PstS1的T細胞表位多肽抗原nPstS1組成一個多組分蛋白抗原，命名為ECP001，包括兩種類型，一種是混合蛋白抗原ECP001m，另一種是融合表達蛋白抗原ECP001f，作為蛋白亞機關疫苗的候選物。将三種蛋白混合或融合後與氫氧化鋁佐劑結合建構一種新型亞機關疫苗，并對疫苗的免疫原性和保護性能進行了小鼠免疫評價。結果表明，ECP001刺激小鼠産生高滴度的IgG、IgG1和IgG2a抗體；同時，小鼠脾細胞分泌高水準的IFN-γ和多種特異性細胞因子。此外，ECP001在體外抑制MTB的增殖能力與卡介苗相當。研究提示ECP001是一種新型有效的多組分亞機關候選疫苗，具有作為卡介苗初始免疫-ECP001加強免疫或治療MTB感染疫苗的潛力。6.二甲雙胍：二甲雙胍通過增加宿主細胞活力和對MTB的直接和獨立的促炎反應來控制其生長。未經二甲雙胍治療的對照組MTB生長速度是二甲雙胍組的14.2倍［17］。二甲雙胍聯合異煙肼控制MTB生長的效果略好于單用異煙肼，表現在二甲雙胍在72 h内調節細胞因子和趨化因子反應的能力比異煙肼更好［17］。另外，二甲雙胍可通過調控多條信号通路來減輕發炎反應，清除細菌，進而發揮輔助抗結核的作用。黃歡等［18］以牛型MTB減毒株（M.bovis）感染THP-1源系巨噬細胞建立實驗模型，二甲雙胍能上調MTB感染巨噬細胞的過氧化物酶增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）表達，進一步抑制p38絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，p38 MAP）活化，進而抑制M bovis感染巨噬細胞發炎反應。PPARγ和p38MAPK作為發炎反應的調節因子，有望成為結核病防治的候選靶标。二甲雙胍可增強免疫應答，促進細菌清除，可成為輔助抗結核治療的候選藥物。7. 大蒜素：大蒜素（allicin）是大蒜中的主要生物活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗菌及免疫調節等作用。已有研究報道大蒜素可抑制發炎反應，降低氧化應激水準，改善肺部病理損傷，進而發揮對MTB感染大鼠的保護作用。趙春燕和高健［19］探讨大蒜素通過磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）通路對MTB感染小鼠模型的影響。研究提示感染組小鼠體品質減輕，MTB數量增多，肺組織病理損傷嚴重；低劑量大蒜素組、高劑量大蒜素組和異煙肼組小鼠對應變化趨勢與上述相反（均P<0.05）。740 Y-P（PI3K 激活劑）減弱了高劑量大蒜素對小鼠發炎反應的抑制作用以及免疫功能的改善作用。故大蒜素可通過抑制PI3K/Akt通路，保護MTB感染小鼠的免疫功能。8. 小檗堿：小檗堿（berberine）是從中藥黃連中提取的一種季铵生物堿，具有抗炎、抗氧化、抗動脈粥樣硬化、抗菌、抗惡性良性腫瘤和神經保護等作用。結核特異抗原持續刺激下誘導T細胞耗竭，而小檗堿可抑制T細胞的糖酵解，調節T細胞活化，預防T細胞耗竭［20］。另外小檗堿可增強宿主對MTB的先天防禦機制，并刺激Th1/Th17特異性效應記憶（TEM）、中樞記憶（TCM）群組織駐留記憶（TRM）反應的分化，增強宿主對藥物敏感和耐藥結核分枝杆菌感染的抵抗力；研究通過對來自結核菌素試驗陽性健康個體的PBMC的全蛋白質組分析，發現小檗堿調節的NOTCH3/PTEN/AKT/FOXO1通路是人CD4+T細胞中TEM和TRM反應升高的主要機制［20］。此外，小檗堿可誘導糖酵解導緻人類和小鼠T細胞中Th1/Th17反應增強。小檗堿對T細胞記憶的調節顯著增強了BCG誘導的抗結核免疫，降低了結核病複發和再感染率。這些結果表明調整免疫記憶是增強宿主抵抗結核病耐藥性的可行方法，小檗堿可作為結核病免疫治療和免疫預防的潛在輔助手段。9.部分抗生素：除了殺菌作用外，部分抗生素還可以幹擾宿主的免疫系統。比阿培南（BPM）是一種碳青黴烯類抗生素，可通過增強p38信号顯著提高先天免疫巨噬細胞的激活狀态，巨噬細胞進一步激活MTB感染小鼠肺和脾的适應性免疫細胞CD4+和CD8+T細胞。BPM治療顯著增強了T淋巴細胞向發炎亞群（如Th1和Th17）的極化，促進産生可以長期生存的中央記憶T細胞亞群。在小鼠模型中，BPM治療促進生成的中央記憶T淋巴細胞亞群，顯著減少結核菌的再激活和再感染，提示BPM可作為一種有效的免疫調節劑輔助治療結核病［21］。另外，越來越多的證據表明，抗生素和免疫調節劑聯合治療具有更好的治療效果。氯法齊明（CFZ）通過阻斷Kv1.3+鉀離子通道促進中央型記憶T（TCM）細胞的生成；雷帕黴素（Rapa）通過誘導自噬促進MTB清除。CFZ和Rapa聯合治療通過誘導強大的T記憶細胞和中央型記憶T細胞，在小鼠模型中有效的減少了耐多藥和廣泛耐藥MTB臨床分離株［22］。作為先天免疫反應的組成部分，抗菌肽（antimicrobial peptides）被認為對MTB具有有效的抗菌活性。Palacios等［23］評估了一種來自印度水牛的抗菌肽：WBCATH，測定其體外抗結核活性、細胞毒性以及該抗菌肽對MTB小鼠肺泡巨噬細胞的細菌負荷及細胞因子分泌的影響。研究表明WBCATH對藥物敏感型和耐多藥型MTB都具有殺菌活性（電鏡下可觀察到MTB結構損傷），并提高小鼠巨噬細胞殺滅MTB能力，誘導保護性細胞因子的産生。WBCATH還可使藥物敏感及耐多藥MTB小鼠體内細菌負荷降低。當一線抗生素與WBCATH聯合使用時，可觀察到協同治療效果。提示這種水牛衍生的抗菌肽可增強保護性免疫反應，縮短抗生素治療時間，可能成為目前抗結核藥物的一種免疫治療方法。
三、臨床試驗相關研究
1. 自然殺傷細胞2族成員C（natural killer cell group 2C，NKG2C）：毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocytes，T-CTL）通過強烈抑制細胞内MTB的生長發揮在抗MTB感染中的免疫保護作用。Shen等［24］研究發現NKG2C在T-CTL中高表達，是CD3+T細胞細胞毒活性的有效激活劑。NKG2C+CD3+T細胞能有效抑制細胞内MTB的生長。在結核病患者中，NKG2C+細胞在CD3+和CD8+T細胞中的比例顯著降低，相反，T細胞毒性活性抑制劑NKG2A在TB患者CD3+和CD8+T細胞的T-CTL中高表達。研究提示結核病患者CTL活性的降低歸因于細胞毒性顆粒分子的低表達和抑制性NKG2A受體的高表達，進而抑制激動劑受體NKG2C。該項研究提示NKG2受體是結核病特别是耐多藥結核病免疫治療的潛在靶點。2.細胞因子免疫治療：細胞因子是通過影響細胞發育、轉運和免疫效應等功能來協調固有免疫和适應性免疫反應的小分子蛋白質。活動性結核病患者補充保護性細胞因子有助于結核病的治療轉歸，安慧茹等［25］系統評價了γ-幹擾素（IFN-γ）聯合抗結核藥物治療肺結核的臨床療效和安全性，分析結果顯示與對照組比較，IFN-γ治療組患者2~3個月末及6~9個月末的痰菌轉陰率、病竈吸收率及空洞閉合率均顯著高于對照組（均P<0.05）。此外，與對照組比較，治療後觀察組外周血CD4+T細胞百分比升高更明顯、CD8+T細胞百分比降低更明顯（均P<0.05）；兩組的不良反應發生率差異均無統計學意義（均P>0.05）。Meta分析結果提示IFN-γ聯合抗結核化學藥物治療肺結核，可促進患者病竈吸收、痰菌轉陰率。3.部分抗生素：德拉馬尼（DLM）是一種分枝杆菌細胞壁真菌酸合成抑制劑，也可以通過調控巨噬細胞發揮免疫治療作用。一項研究納入23例耐多藥結核病患者，其中13例采用優化背景治療方案（OBR）+DLM方案（OBR+DLM）治療，10例采用OBR+安慰劑治療，OBR+DLM組患者在治療後CXCL10水準明顯低于對照組；在細胞模型中，DLM抑制JAK/STAT通路，并抑制PBMC的遷移，進而顯著抑制CXCL10的表達［26］。提示DLM通過調控JAK2/STAT1信号通路抑制CXCL10的表達，并與耐多藥結核病患者發炎反應減輕相關。研究提示DLM可作為一種潛在的藥物用于CXCL10反應升高患者的免疫治療。此外，CFZ和Rapa聯合治療可降低人巨噬細胞中MTB潛伏期相關基因的表達［22］，有望治療耐多藥和廣泛耐藥結核患者。
四、總結與展望
目前，結核病的治療提倡以化療為主，免疫治療等為輔助治療的綜合治療模式，尤其對于耐多藥及廣泛耐藥結核病的免疫治療需求更加明顯。2022年10月—2023年9月，結核病的免疫治療分别在以宿主自噬相關基因作為治療靶點，宿主巨噬細胞及毒性T淋巴細胞、蛋白酶作為治療靶點，以及谷氨酰胺代謝作為研究靶點方面取得一定的進展；以Vγ2Vδ2 T細胞、間充質幹細胞為代表的細胞免疫治療獲得一定的臨床療效；治療性疫苗及部分抗生素及抗結核藥物具有一定的免疫治療作用。在目前的研究進展中，探索宿主靶向治療新靶點以及新型治療性疫苗的研究是免疫治療的熱點及重點，通過調控宿主細胞的固有免疫效應及适應性免疫效應獲得宿主免疫保護性效應的提高、細胞殺菌能力的提升是諸多免疫治療研究的最終目的。目前免疫治療的機制仍未完全闡明，免疫治療的時機、療程等尚不完全明确，需要更多高品質的臨床研究來對免疫治療進行評估探索。結核病的免疫治療對改善結核病患者的治療轉歸、切斷傳播鍊、控制傳染病具有重要的防控意義。
參考文獻（略）