作者：柯荟 范琳
单位：同济大学附属上海市肺科医院结核科 上海市感染性疾病（结核病）医学临床研究中心 上海市结核（肺）重点实验室
引用本文: 柯荟, 范琳. 结核病免疫治疗年度进展2023 [J] . 中华结核和呼吸杂志, 2024, 47(4) : 371-375. DOI: 10.3760/cma.j.cn112147-20231031-00283.
摘要
结核病作为一种慢性感染性疾病，与免疫调控及免疫效应密切相关。免疫治疗作为结核病综合治疗的重要手段之一，可改善结核病的疗效、控制结核病的传播。2022年10月至2023年9月，国内外进行了多项关于结核病的免疫治疗研究，对耐多药、广泛耐药结核的治疗提供了新的可能。宿主靶向治疗及治疗性疫苗的研究是结核病辅助治疗探索的新方向。
由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的结核病仍然是导致传染病死亡的主要原因。尽管近年来，结核病的诊断、治疗和疫苗研发方面取得了一定的进展，但全球的结核病疫情仍然不容乐观，根据世界卫生组织发布的《2023年全球结核病报告》，2022年全球估算结核病发病数为1 060万例，死亡130万例，耐多药/利福平耐药结核病（MDR/RR-TB）病例41万例［1］。结核病是慢性感染性疾病，疾病的发病及进展与宿主的免疫状态密切相关，免疫治疗是结核病治疗的重要方法之一，结核病可通过免疫治疗调节机体的免疫效应，以达到加快痰菌转阴、提高治疗成功率、缩短疗程的目的。本文拟将2022年10月至2023年9月结核病免疫治疗研究的进展，从细胞实验、动物实验、临床研究三个层面进行综述。
一、细胞实验相关研究
宿主导向治疗是近年来结核病免疫治疗的主要策略之一，该策略将抗菌的治疗方向转为针对宿主的靶细胞、靶蛋白，通过小分子调控宿主的免疫功能，包括老药新用、营养制剂、单克隆抗体、免疫调节剂等，通过调节宿主的免疫功能达到免疫治疗的目的［2］。MTB有多种抗原通过各种模式识别受体与宿主细胞发生作用，其中Toll样受体（TLR）2和4是两种主要的模式识别受体，不同的MTB配体激活TLR2/4受体，通过激活下游信号级联拮抗或激动的方式改变宿主免疫反应［3］。了解免疫网络之间的信号网络和交叉对话对于开发针对MTB的宿主定向免疫策略非常重要。确定结核病免疫治疗的宿主靶向靶点和免疫反应分子标志物是迫切而有意义的。既往研究已证明自噬在结核病的感染过程和感染后发病过程中都起着重要作用，并与结核病治疗的预后有关。细胞因子治疗和细胞因子介导的自噬已被用作主要的宿主导向治疗方法来抑制MTB在宿主细胞中的生长。Mishra等［4］研究了大豆凝集素（SBL）通过细胞因子介导的自噬诱导分化的THP-1（dTHP-1）细胞的抗结核活性。在SBL治疗后，已感染MTB的dTHP-1细胞通过P2X配体门控离子通道7受体（purinergic receptor P2X，ligand-gated ion channel 7，P2RX7）介导的途径，白细胞介素（IL）-6的表达显著增加。SBL与P2RX7相互作用调节PI3K/Akt/CREB网络，促进dTHP-1细胞分泌释放IL-6，IL-6反过来可激活JAK2/STAT3/Mcl-1途径，通过与IL-6Rα相互作用来调节自噬，最终控制巨噬细胞中的MTB的生长。另外，Xiao等［5］研究发现萝卜硫素（SFN）通过增强THP-1细胞的自噬来降低细胞内的细菌负荷，研究显示自噬相关基因与结核病的免疫浸润相关，SFN可调控自噬相关的三个关键基因，尤其是自噬相关基因FOXO1，后者将为临床结核病的诊断和免疫治疗策略提供新的靶标。由于MTB感染宿主后主要持留于巨噬细胞中，因此将抗结核药物靶向作用于巨噬细胞可有助于提高抗结核效果。磷脂酰丝氨酸（PS）是一种生物膜磷脂，常存在于细胞膜内侧。细胞凋亡时，PS可以从细胞膜内侧翻转到细胞膜表面，显示出特异性的“eat-me”信号，被巨噬细胞上的特异性受体所识别。Tian等［6］利用PS的这种巨噬细胞靶向特性构建了PCN-CpG@PS纳米复合材料，形成靶向给药系统。在这项研究中。CpG寡脱氧核苷酸（CpG oligodeoxynucleotides，CpG ODNs）是人工合成的寡脱氧核糖核苷酸序列，可通过刺激哺乳动物免疫细胞中的TLR来诱导Th1型免疫反应杀死MTB。然而，由于CpG ODNs的负电荷和易降解的特征，需要使用纳米材料将其输送到细胞中。PCN-CpG@PS旨在靶向病变部位的巨噬细胞并杀死潜伏在胞内的MTB，研究表明该靶向纳米复合材料具有一定的体外抗结核效果及良好的安全性。Kumari等［7］在另一项研究中探索了醉茄素A（withaferin A，WA）作为结核病免疫治疗药物的作用，研究提示WA可通过增强宿主的免疫反应来抑制细胞内存活的MTB，还可引导宿主的巨噬细胞向防御性M1极化方向转化，增强宿主对MTB感染的Th1和Th17型免疫反应。提示WA可作为一种有效的辅助免疫调节剂，通过促进STAT信号传导增强宿主保护性记忆细胞的功能，从而提高宿主对MTB的防御能力。
二、动物实验相关研究
1.以谷氨酰胺代谢拮抗剂JHU083为靶点治疗：MTB已经进化出一系列不同的决定因素来破坏宿主免疫并改变宿主代谢模式。然而，研究病原体干扰宿主的代谢机制仍然知之甚少。Parveen等［8］研究证明了一种新的谷氨酰胺代谢拮抗剂JHU083在体外及体内均可抑制MTB的增殖，表现在JHU083治疗下小鼠的体重增加、存活率提高，感染后35 d肺部细菌负荷降低2.5 log，肺部病理损伤减轻。与未感染和利福平治疗的对照组相比，JHU083治疗可更早地启动T细胞募集、增加促炎髓样细胞浸润、减少抑制性髓样细胞的聚集。经JHU083治疗的MTB感染小鼠，将其肺部组织进行代谢组学分析结果显示谷氨酰胺水平降低、瓜氨酸积累、一氧化氮（NO）合酶活性升高，同时喹啉酸（为免疫抑制代谢物犬尿氨酸所产生）水平降低。JHU083处理的巨噬细胞则可产生更多的NO，增强巨噬细胞的抗菌活性。在免疫功能低下的MTB感染的小鼠模型中进行测试时，发现JHU083治疗效果降低，表明该药物作用下引起的宿主导向的免疫调节作用在疗效中占主导地位。因此，JHU083作为谷氨酰胺代谢拮抗剂对MTB具有免疫调节和抗菌的双重作用，具有有效的宿主导向抗结核活性。2. 以蛋白酶为靶点治疗：宿主细胞的组织蛋白酶可以调控MTB、降低巨噬细胞的蛋白水解活性，从而提高病原体的存活率，是很有潜力的治疗靶点。Mandal等［9］研究提示酶蛋白抑制剂胱抑素F在MTB感染期间在宿主细胞中表达明显增多。使用siRNA沉默胱抑素F可以提高组织蛋白酶S、L、B的蛋白水解活性，显著影响巨噬细胞内病原体的杀伤力，提示胱抑素F可作为结核病尤其是耐多药和广泛耐药结核病潜在的免疫治疗手段。另外，在MTB中，酪蛋白溶解蛋白酶P（ClpP）蛋白水解后包括ClpP1、ClpP2、AAA1伴侣蛋白，其中ClpP及其AAA1伴侣可维持MTB细胞中的蛋白稳态，对细菌生存至关重要，是重要的生物学靶点之一［10］，具有开发治疗耐多药结核病新药的潜能。在过去的10年里，许多靶向MTB ClpP1P2的调节剂已被鉴定和表征，其中一些已显示出有效的抗结核活性［10］。3.Vγ2Vδ2 T细胞免疫治疗：既往研究提示磷酸抗原特异性Vγ2Vδ2 T细胞在结核病免疫中可发挥保护作用。增强保护性Vγ2Vδ2 效应T细胞可改善MDR-TB患者的治疗效果。Shen等［11］使用临床批准的药物唑来膦酸钠（ZOL）和白细胞介素2（IL-2）诱导具有抗结核作用的Vγ2Vδ2效应T细胞，作为感染MDR-TB菌株的猕猴的辅助免疫治疗。研究提示给感染MDR-TB菌株的猕猴使用ZOL/IL-2作为化学治疗的辅助治疗，可显著扩增Vγ2Vδ2 T细胞，增强并维持Vγ2Vδ2 效应T细胞亚群分泌保护性细胞因子，且效应可维持至用药后的第21周。ZOL/IL-2在增加Vγ2Vδ2 T细胞数量的同时，还能显著增加并维持血循环中CD4+Th1和CD8+Th1样效应细胞的数量，在MDR-TB感染后的第3周，γδ T细胞或αβ效应T细胞可迁移到气道，效应维持到第19或21周。研究结果表明与对照组比较，辅助使用ZOL/IL-2可显著降低宿主肺部的细菌负荷，减轻耐多药结核病宿主体内的病理损伤。由此可见，唑来膦酸钠联合IL-2可提高具有抗结核作用的Vγ2vδ2 T细胞和αβ效应T细胞的数量，从而提高MDR-TB的治疗效果。4. 间充质干细胞免疫治疗：间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）具有多种功能，包括再生、促进伤口愈合、调节免疫信号等。这些多功能干细胞在调节免疫系统的各个方面也起着至关重要的作用，MTB可感染间充质干细胞并躲避免疫系统对其的消灭，已有研究表明间充质干细胞可作为结核病的辅助疗法。Chenari等［12］通过感染卡介苗（BCG）建立BALB/c小鼠肺炎症模型，探讨鼻腔给予MSC上清液的治疗作用。研究从小鼠脂肪组织中分离出间充质干细胞，第三代传代后，收集细胞培养液。结果提示感染卡介苗组的小鼠，在给予补充间充质干细胞后，小鼠的肺泡灌洗液中TNF-α/IL-10比值明显下降，研究提示MSC治疗可减少肺组织的损伤、诱导有效的免疫保护应答。5.治疗性疫苗：传统的卡介苗接种是皮内注射，通过另一种途径提供卡介苗可能会增强保护的深度和广度。Kurtz等［13］利用多样性外交杂（DO）小鼠来检测卡介苗通过静脉注射给药时诱导的保护作用。研究发现与皮下接种疫苗的小鼠相比，静脉注射接种的DO小鼠在其整个器官中有更大的卡介苗分布，但小鼠肺和脾脏的MTB负担没有显著减少，肺部炎症也没有显著改变。尽管如此，静脉注射卡介苗的DO小鼠比通过传统途径接种的小鼠存活率更高，并在不同的小动物模型中检测到，静脉注射途径递送卡介苗可以增强保护作用。MTB Ag85A和Ag85B蛋白是宿主先天免疫细胞早期识别的分泌蛋白和抗原，具有良好的免疫原性。既往研究开发了ag85a/b嵌合DNA疫苗通过肌内注射（IM）和电穿孔（EP）接种在MTB小鼠模型中可以诱导显著的Th1和CTL细胞免疫反应，但是这两种疫苗免疫方法之间的作用机制尚不清楚。Wang等［14］研究提示MTB小鼠大部分上调的差异基因与营养物质的消化吸收或神经内分泌有关，而大部分下调的差异基因与细胞结构和功能蛋白有关，尤其是肺泡上皮细胞的结构和功能蛋白。在Ag85a/b DNA IM组及EP组中，大部分异常上调或下调的差异基因得到恢复。研究提示MTB感染引起小鼠分解代谢加快，合成代谢减慢，无论是肌肉注射还是电穿孔免疫有效剂量的ag85a/b DNA疫苗均能显著上调免疫相关通路，恢复MTB引起的代谢紊乱和损伤。新型多组分疫苗将多种免疫优势抗原结合，形成具有广谱抗原的疫苗，诱导保护性免疫应答是结核病疫苗发展的趋势。Wang等［15］ 利用T细胞富含表位的蛋白亚基构建了三个抗原组合：EPC002、ECA006、EPCP009。纯化蛋白EPC002f、ECA006f、EPCP009f和重组纯化蛋白混合物EPC002m（CFP-10、ESAT-6和nPPE18的混合物）、ECA006m（CFP-10、ESAT-6和Ag85B的混合物）和EPCP009m（CFP-10、ESAT-6、nPPE18和nPstS1的混合物）作为抗原，用明胶佐剂配制。通过BALB/c小鼠免疫实验，分析其免疫原性和疗效。体外MTB生长抑制实验表明，EPCP009m对MTB生长的抑制作用最强，显著优于其他4种候选疫苗。含有4种免疫优势抗原的EPCP009m在体外具有较好的免疫原性和抑制MTB生长的能力，可能是一种有前景的结核控制候选疫苗。另外，Yu等［16］选择ESAT-6、CFP-10、两个全长抗原和PstS1的T细胞表位多肽抗原nPstS1组成一个多组分蛋白抗原，命名为ECP001，包括两种类型，一种是混合蛋白抗原ECP001m，另一种是融合表达蛋白抗原ECP001f，作为蛋白亚单位疫苗的候选物。将三种蛋白混合或融合后与氢氧化铝佐剂结合构建一种新型亚单位疫苗，并对疫苗的免疫原性和保护性能进行了小鼠免疫评价。结果表明，ECP001刺激小鼠产生高滴度的IgG、IgG1和IgG2a抗体；同时，小鼠脾细胞分泌高水平的IFN-γ和多种特异性细胞因子。此外，ECP001在体外抑制MTB的增殖能力与卡介苗相当。研究提示ECP001是一种新型有效的多组分亚单位候选疫苗，具有作为卡介苗初始免疫-ECP001加强免疫或治疗MTB感染疫苗的潜力。6.二甲双胍：二甲双胍通过增加宿主细胞活力和对MTB的直接和独立的促炎反应来控制其生长。未经二甲双胍治疗的对照组MTB生长速度是二甲双胍组的14.2倍［17］。二甲双胍联合异烟肼控制MTB生长的效果略好于单用异烟肼，表现在二甲双胍在72 h内调节细胞因子和趋化因子反应的能力比异烟肼更好［17］。另外，二甲双胍可通过调控多条信号通路来减轻炎症反应，清除细菌，从而发挥辅助抗结核的作用。黄欢等［18］以牛型MTB减毒株（M.bovis）感染THP-1源系巨噬细胞建立实验模型，二甲双胍能上调MTB感染巨噬细胞的过氧化物酶增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）表达，进一步抑制p38丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，p38 MAP）活化，从而抑制M bovis感染巨噬细胞炎症反应。PPARγ和p38MAPK作为炎症反应的调节因子，有望成为结核病防治的候选靶标。二甲双胍可增强免疫应答，促进细菌清除，可成为辅助抗结核治疗的候选药物。7. 大蒜素：大蒜素（allicin）是大蒜中的主要生物活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗菌及免疫调节等作用。已有研究报道大蒜素可抑制炎症反应，降低氧化应激水平，改善肺部病理损伤，进而发挥对MTB感染大鼠的保护作用。赵春燕和高健［19］探讨大蒜素通过磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）通路对MTB感染小鼠模型的影响。研究提示感染组小鼠体质量减轻，MTB数量增多，肺组织病理损伤严重；低剂量大蒜素组、高剂量大蒜素组和异烟肼组小鼠对应变化趋势与上述相反（均P<0.05）。740 Y-P（PI3K 激活剂）减弱了高剂量大蒜素对小鼠炎症反应的抑制作用以及免疫功能的改善作用。故大蒜素可通过抑制PI3K/Akt通路，保护MTB感染小鼠的免疫功能。8. 小檗碱：小檗碱（berberine）是从中药黄连中提取的一种季铵生物碱，具有抗炎、抗氧化、抗动脉粥样硬化、抗菌、抗肿瘤和神经保护等作用。结核特异抗原持续刺激下诱导T细胞耗竭，而小檗碱可抑制T细胞的糖酵解，调节T细胞活化，预防T细胞耗竭［20］。另外小檗碱可增强宿主对MTB的先天防御机制，并刺激Th1/Th17特异性效应记忆（TEM）、中枢记忆（TCM）和组织驻留记忆（TRM）反应的分化，增强宿主对药物敏感和耐药结核分枝杆菌感染的抵抗力；研究通过对来自结核菌素试验阳性健康个体的PBMC的全蛋白质组分析，发现小檗碱调节的NOTCH3/PTEN/AKT/FOXO1通路是人CD4+T细胞中TEM和TRM反应升高的主要机制［20］。此外，小檗碱可诱导糖酵解导致人类和小鼠T细胞中Th1/Th17反应增强。小檗碱对T细胞记忆的调节显著增强了BCG诱导的抗结核免疫，降低了结核病复发和再感染率。这些结果表明调整免疫记忆是增强宿主抵抗结核病耐药性的可行方法，小檗碱可作为结核病免疫治疗和免疫预防的潜在辅助手段。9.部分抗生素：除了杀菌作用外，部分抗生素还可以干扰宿主的免疫系统。比阿培南（BPM）是一种碳青霉烯类抗生素，可通过增强p38信号显著提高先天免疫巨噬细胞的激活状态，巨噬细胞进一步激活MTB感染小鼠肺和脾的适应性免疫细胞CD4+和CD8+T细胞。BPM治疗显著增强了T淋巴细胞向炎症亚群（如Th1和Th17）的极化，促进产生可以长期生存的中央记忆T细胞亚群。在小鼠模型中，BPM治疗促进生成的中央记忆T淋巴细胞亚群，显著减少结核菌的再激活和再感染，提示BPM可作为一种有效的免疫调节剂辅助治疗结核病［21］。另外，越来越多的证据表明，抗生素和免疫调节剂联合治疗具有更好的治疗效果。氯法齐明（CFZ）通过阻断Kv1.3+钾离子通道促进中央型记忆T（TCM）细胞的生成；雷帕霉素（Rapa）通过诱导自噬促进MTB清除。CFZ和Rapa联合治疗通过诱导强大的T记忆细胞和中央型记忆T细胞，在小鼠模型中有效的减少了耐多药和广泛耐药MTB临床分离株［22］。作为先天免疫反应的组成部分，抗菌肽（antimicrobial peptides）被认为对MTB具有有效的抗菌活性。Palacios等［23］评估了一种来自印度水牛的抗菌肽：WBCATH，测定其体外抗结核活性、细胞毒性以及该抗菌肽对MTB小鼠肺泡巨噬细胞的细菌负荷及细胞因子分泌的影响。研究表明WBCATH对药物敏感型和耐多药型MTB都具有杀菌活性（电镜下可观察到MTB结构损伤），并提高小鼠巨噬细胞杀灭MTB能力，诱导保护性细胞因子的产生。WBCATH还可使药物敏感及耐多药MTB小鼠体内细菌负荷降低。当一线抗生素与WBCATH联合使用时，可观察到协同治疗效果。提示这种水牛衍生的抗菌肽可增强保护性免疫反应，缩短抗生素治疗时间，可能成为当前抗结核药物的一种免疫治疗方法。
三、临床试验相关研究
1. 自然杀伤细胞2族成员C（natural killer cell group 2C，NKG2C）：毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes，T-CTL）通过强烈抑制细胞内MTB的生长发挥在抗MTB感染中的免疫保护作用。Shen等［24］研究发现NKG2C在T-CTL中高表达，是CD3+T细胞细胞毒活性的有效激活剂。NKG2C+CD3+T细胞能有效抑制细胞内MTB的生长。在结核病患者中，NKG2C+细胞在CD3+和CD8+T细胞中的比例显著降低，相反，T细胞毒性活性抑制剂NKG2A在TB患者CD3+和CD8+T细胞的T-CTL中高表达。研究提示结核病患者CTL活性的降低归因于细胞毒性颗粒分子的低表达和抑制性NKG2A受体的高表达，从而抑制激动剂受体NKG2C。该项研究提示NKG2受体是结核病特别是耐多药结核病免疫治疗的潜在靶点。2.细胞因子免疫治疗：细胞因子是通过影响细胞发育、转运和免疫效应等功能来协调固有免疫和适应性免疫反应的小分子蛋白质。活动性结核病患者补充保护性细胞因子有助于结核病的治疗转归，安慧茹等［25］系统评价了γ-干扰素（IFN-γ）联合抗结核药物治疗肺结核的临床疗效和安全性，分析结果显示与对照组比较，IFN-γ治疗组患者2~3个月末及6~9个月末的痰菌转阴率、病灶吸收率及空洞闭合率均显著高于对照组（均P<0.05）。此外，与对照组比较，治疗后观察组外周血CD4+T细胞百分比升高更明显、CD8+T细胞百分比降低更明显（均P<0.05）；两组的不良反应发生率差异均无统计学意义（均P>0.05）。Meta分析结果提示IFN-γ联合抗结核化学药物治疗肺结核，可促进患者病灶吸收、痰菌转阴率。3.部分抗生素：德拉马尼（DLM）是一种分枝杆菌细胞壁真菌酸合成抑制剂，也可以通过调控巨噬细胞发挥免疫治疗作用。一项研究纳入23例耐多药结核病患者，其中13例采用优化背景治疗方案（OBR）+DLM方案（OBR+DLM）治疗，10例采用OBR+安慰剂治疗，OBR+DLM组患者在治疗后CXCL10水平明显低于对照组；在细胞模型中，DLM抑制JAK/STAT通路，并抑制PBMC的迁移，从而显著抑制CXCL10的表达［26］。提示DLM通过调控JAK2/STAT1信号通路抑制CXCL10的表达，并与耐多药结核病患者炎症反应减轻相关。研究提示DLM可作为一种潜在的药物用于CXCL10反应升高患者的免疫治疗。此外，CFZ和Rapa联合治疗可降低人巨噬细胞中MTB潜伏期相关基因的表达［22］，有望治疗耐多药和广泛耐药结核患者。
四、总结与展望
目前，结核病的治疗提倡以化疗为主，免疫治疗等为辅助治疗的综合治疗模式，尤其对于耐多药及广泛耐药结核病的免疫治疗需求更加明显。2022年10月—2023年9月，结核病的免疫治疗分别在以宿主自噬相关基因作为治疗靶点，宿主巨噬细胞及毒性T淋巴细胞、蛋白酶作为治疗靶点，以及谷氨酰胺代谢作为研究靶点方面取得一定的进展；以Vγ2Vδ2 T细胞、间充质干细胞为代表的细胞免疫治疗获得一定的临床疗效；治疗性疫苗及部分抗生素及抗结核药物具有一定的免疫治疗作用。在目前的研究进展中，探索宿主靶向治疗新靶点以及新型治疗性疫苗的研究是免疫治疗的热点及重点，通过调控宿主细胞的固有免疫效应及适应性免疫效应获得宿主免疫保护性效应的提高、细胞杀菌能力的提升是诸多免疫治疗研究的最终目的。目前免疫治疗的机制仍未完全阐明，免疫治疗的时机、疗程等尚不完全明确，需要更多高质量的临床研究来对免疫治疗进行评估探索。结核病的免疫治疗对改善结核病患者的治疗转归、切断传播链、控制传染病具有重要的防控意义。
参考文献（略）