引言
在細胞發育、疾病和衰老過程中，野生型和突變型線粒體DNA（mtDNA）共存現象稱為異質性（heteroplasmy），其水準在不同生物狀态下會動态變化。4月24日發表于Nature的研究“Single-cell analysis reveals context-dependent, cell-level selection of mtDNA”，着眼于線粒體DNA（mtDNA）的細胞水準選擇與異質性。研究通過結合精确的mtDNA堿基編輯技術（DdCBE）和新方法SCI-LITE（單細胞組合索引技術），揭示了在标準培養條件下，細胞群體會清除非同義mtDNA變異，而保留同義變異，表明選擇作用而非簡單的漂移在塑造群體異質性中起主導作用。同時，研究還追蹤了單細胞mtDNA異質性及其血統，發現盡管群體異質性發生了變化，但單個細胞系的異質性保持穩定，這表明選擇作用是在細胞健康的層面上。
此外，通過将細胞置于特定環境中，研究顯示在需要降低生化複合體I（complex I）活性的環境中，可以促使細胞積累高水準的截斷型complex I mtDNA異質性，這對細胞健康可能是有益的。這些發現不僅對了解mtDNA在細胞中的動态變化具有重要意義，而且對于探索與年齡相關的退行性疾病的發生機制及其可能的遺傳基礎提供了新的視角。
綜上所述，該研究強調了細胞環境對mtDNA異質性動态的影響，并提出了在細胞分裂過程中，非同義異質性的選擇性清除，支援了一個全新的觀點：即mtDNA的選擇不僅僅是随機事件，而是一個複雜的、受多種因素影響的過程，其中細胞健康水準和外部環境條件起着決定性作用。這項研究不僅為我們提供了關于mtDNA異質性的深入了解，也為未來可能的治療政策提供了理論基礎。
Highlights
精确的mtDNA編輯技術（Precise mtDNA Base Editing）該研究成功應用了精确的線粒體DNA堿基編輯技術（DdCBE），這一技術能夠精确地修改單細胞中的mtDNA，進而研究不同mtDNA變異對細胞行為的影響。通過這種方法，研究人員能夠在細胞水準上觀察到mtDNA異質性（heteroplasmy）的動态變化，并揭示了這些變化是如何通過選擇而非随機漂移來驅動的。
高通量單細胞異質性分析工具SCI-LITE（High-Throughput Single-Cell Heteroplasmy Analysis with SCI-LITE）研究中引入了一種新的單細胞組合索引技術（SCI-LITE），該技術能夠在超高通量情況下追蹤單細胞的mtDNA異質性。SCI-LITE的使用大幅提升了研究的靈敏度和擴充性，使得科學家可以更加詳細地分析和了解mtDNA在單個細胞中的行為及其變化。
環境依賴的選擇作用（Environment-Dependent Selection）該研究發現，細胞在不同的培養環境中展現出不同的mtDNA異質性動态。在某些環境中，特定的非同義（nonsynonymous）mtDNA變異會因為對細胞健康（cell fitness）有益而被積極選擇。這一發現表明，mtDNA異質性的變化與外部環境條件密切相關，環境因素可以顯著影響mtDNA的選擇過程。
對細胞健康的影響（Impact on Cell Fitness）研究展示了mtDNA異質性如何影響細胞的生長與增殖能力。通過詳細分析不同異質性水準的細胞，研究指出非同義異質性通常對細胞健康有負面影響，但在特定條件下這種影響可以轉變為正面。這種現象在mtDNA研究領域提供了新的見解，對于了解複雜I（complex I）功能障礙在疾病中的角色尤為重要。
Strategies
研究團隊從線粒體DNA異質性（mtDNA heteroplasmy）的動态變化入手，探讨在細胞發展、疾病和衰老中這些變化的内在機制。特别關注的是，這些變化是通過随機漂移（drift）還是通過選擇（selection）來推動的，以及這些過程在細胞層面還是細胞内層面發生。
精确的mtDNA堿基編輯技術（DdCBE）研究中使用了一種稱為DdCBE的線粒體堿基編輯技術，這種技術允許研究者在不使用CRISPR的情況下精确修改mtDNA。通過這種技術，研究人員可以引入同義（synonymous）和非同義（nonsynonymous）突變，進而觀察這些突變如何在細胞中影響mtDNA的異質性水準。
單細胞組合索引技術SCI-LITE為了在單細胞水準上分析mtDNA異質性，研究團隊開發了一種名為SCI-LITE的新方法。這種方法結合了單細胞組合索引（single-cell combinatorial indexing, SCI）和靈敏的單細胞RNA測序技術，允許研究人員在極高的通量下測定特定轉錄物。SCI-LITE技術通過多輪的池化（pooling）和分裂（splitting）過程，利用條形碼（barcodes）和獨特分子辨別符（unique molecular identifiers, UMIs）對單個細胞進行标記。
環境因素的考察研究進一步探讨了環境因素如何影響mtDNA異質性的選擇。通過将細胞置于依賴或不依賴線粒體氧化磷酸化（OXPHOS）的不同能量來源環境中，研究團隊觀察到非同義突變的mtDNA在特定條件下如何被選擇性保留或清除。這一發現提示，mtDNA異質性的選擇不僅受到遺傳變異的影響，還受到外部環境的強烈影響。
異質性動态的追蹤通過SCI-LITE技術，研究人員能夠跟蹤細胞群體中的異質性動态以及單個細胞系的異質性穩定性。這種技術的應用提供了一種全新的視角來了解mtDNA異質性是如何在不同細胞狀态和環境壓力下變化的。
Behind the Scenes
線粒體DNA堿基編輯技術（DdCBE）線粒體DNA堿基編輯技術（DdCBE）是一種特别設計的技術，用于在不依賴CRISPR系統的情況下精确編輯線粒體DNA（mtDNA）。此技術利用了一種被稱為“去氨基酶”（deaminase）的酶，該酶可以特異性地修改DNA堿基，進而引入突變。在DdCBE中，去氨基酶被融合到一個特定的DNA結合蛋白上，這使得編輯複合物能夠精确地靶向mtDNA，并引入所需的突變。
堿基轉換機制DdCBE技術主要利用的是一種稱為胞嘧啶去氨基酶（cytidine deaminase），它能夠将胞嘧啶（C）轉換為尿嘧啶（U）。在DNA複制過程中，這種轉換可以導緻堿基對從C-G變為T-A，進而在DNA序列中引入點突變。這種編輯技術不需要DNA切割或雙鍊斷裂，進而減少了細胞修複過程中可能引入的額外突變。
實驗流程在開始實驗之前，研究者需要設計特定的融合蛋白，包括選擇合适的DNA結合域來確定蛋白能夠精确地靶向特定的mtDNA區域。這通常涉及到對mtDNA的序列進行詳細分析，以識别可以作為結合位點的序列。建構所需的融合蛋白是實驗的第一步。這涉及到将去氨基酶基因與特定的DNA結合蛋白基因（如TALE或其他DNA結合子產品）通過分子克隆技術融合。然後通過正常的細胞生物學方法将建構的質粒轉染入細胞中。轉染後，融合蛋白會進入細胞并最終靶向線粒體。蛋白的定位标簽（如線粒體定位序列）確定了蛋白能夠正确地傳輸到線粒體内部。一旦融合蛋白到達線粒體，去氨基酶就會活化并開始編輯靶向序列附近的堿基。這個過程通常在細胞分裂過程中發生，當DNA複制時，引入的U會被視作T，導緻堿基對的永久改變。實驗的最後一步是驗證編輯的效果。這通常涉及到使用PCR技術擴增編輯區域的mtDNA，然後通過測序來确定是否成功引入了預期的突變。此外，還需要評估編輯的特異性和效率，以確定沒有在非目标區域引入突變。
高通量單細胞異質性分析工具SCI-LITESCI-LITE（Single-Cell Combinatorial Indexing Leveraged to Interrogate Targeted Expression）是一種革新的高通量單細胞分析工具，用于研究線粒體DNA（mtDNA）的異質性（heteroplasmy）。它結合了單細胞組合索引（Single-Cell Combinatorial Indexing, SCI）和靶向表達查詢技術，能夠在單細胞水準上同時分析多個轉錄物。SCI-LITE技術首先利用一個固定和滲透的細胞樣本，将這些細胞配置設定到多孔闆中的獨立孔内。在每個孔中，針對特定基因的反轉錄（Reverse Transcription, RT）引物被使用，這些引物帶有特異的條形碼（Barcode），允許後續通過序列來識别來自不同細胞的轉錄物。細胞被再次混合和重新配置設定到新的孔中進行配對末端标記（ligation），添加第二個唯一分子辨別符（Unique Molecular Identifier, UMI）和第二個條形碼。這一步驟提供了進一步的組合多樣性，極大地提升了能夠标記的單個細胞的數量。最後，進行PCR擴增，引入額外的條形碼并為測序做準備。
SCI-LITE的優勢高通量與靈敏度SCI-LITE技術的設計使其具有極高的通量和靈敏度，可以處理數以萬計的單細胞樣本，同時保持每個細胞的獨特識别。這種高通量能力特别适合進行大規模的生物醫學研究，如探索異質性在多種疾病中的作用。
成本效益相較于傳統的單細胞RNA測序（scRNA-seq）技術，SCI-LITE通過使用組合索引減少了必需的測序深度，進而降低了成本。這種方法通過減少必需的測序循環次數，同時提供相似或更高的資料品質，使其在資源有限的情況下成為更優的選擇。
靈活性與可擴充性SCI-LITE允許研究者針對特定基因集進行定制化分析，這增加了方法的靈活性，使其可以針對不同的研究目的進行優化。此外，該技術的設計支援橫向擴充，可用于更大規模的樣本處理。
減少樣本損失通過在多孔闆中進行處理和條形碼的添加，SCI-LITE最大化了樣本的使用率，減少了在傳統單細胞分離和進行中常見的細胞損失。這對于處理珍貴或難以擷取的生物樣本尤為重要。
環境依賴的選擇作用（Environment-Dependent Selection）在研究中，環境依賴的選擇作用（Environment-Dependent Selection）指的是線粒體DNA（mtDNA）異質性在不同環境條件下如何受到自然選擇的影響，導緻特定的mtDNA變異在某些環境中得以保留或消除。此研究探讨了細胞在不同能量需求環境下對mtDNA變異的選擇響應。研究人員利用高通量單細胞異質性分析工具SCI-LITE對經過特定mtDNA基因編輯的細胞群體進行了分析。通過改變培養基中的糖類來源（如葡萄糖（Glucose）和半乳糖（Galactose）），模拟不同的細胞代謝需求環境。葡萄糖作為一種高效的能源物質，而半乳糖則迫使細胞依賴于線粒體氧化磷酸化（OXPHOS）來産生能量。在不同的培養條件下觀察并記錄了含有同義和非同義突變的mtDNA的異質性水準。使用SCI-LITE技術，研究人員能夠準确測量單個細胞中特定mtDNA突變的頻率，并跟蹤這些頻率在不同培養條件下的變化。在葡萄糖環境中，非同義突變的mtDNA異質性水準有所下降，表明這些突變對細胞代謝在高能源條件下可能具有負面影響。在半乳糖環境中，這種下降更為顯著，表明當細胞依賴于OXPHOS時，非同義突變對細胞生存的負面影響更大。同義突變的異質性水準在兩種條件下均保持穩定，說明這些突變不影響細胞的能量代謝。
潛在的局限性環境因素的高度依賴性（High Dependency on Environmental Factors）該研究突顯了環境因素對mtDNA異質性（mtDNA heterogeneity）影響細胞健康（cell fitness）的重要性。雖然環境敏感性是該研究的一個創新點，但這也意味着其結論可能不适用于不同的生理或病理環境。環境的高度依賴性限制了研究結果的普适性，因為不同環境下的細胞反應可能截然不同。
資料的代表性和适用性限制（Limitations in Data Representativeness and Applicability）盡管研究使用了先進的單細胞測序技術（SCI-LITE）來分析異質性動态，但所研究的細胞類型和條件可能不完全代表人體内更廣泛或複雜的生物系統。此外，實驗條件的人工設定可能影響了研究結果的生物醫學适用性，因為體外實驗條件往往無法完全模拟生物體内的複雜互動和微環境。
異質性動态的解釋挑戰（Challenges in Interpreting Heteroplasmy Dynamics）研究中對異質性水準的變化進行了詳細的觀察和分析，但解釋這些動态仍然具有挑戰性。異質性的測量和解釋依賴于高度專業化的技術和分析方法，這可能限制了研究的可重複性和其他科研人員的驗證工作。此外，對異質性影響的機制了解還不完全，可能需要進一步的研究來闡明這些複雜的分子過程。
潛在的研究方向了解mtDNA異質性動态該研究結合使用mtDNA堿基編輯和一種新方法SCI-LITE來研究單個細胞中異質性水準如何随時間變化。這揭示了異質性可以受到遺傳選擇和環境因素的影響，這取決于細胞環境。未來的研究可更深入地探索這些動态如何受到不同細胞環境或應激條件的影響。
單細胞mtDNA分析技術SCI-LITE提供了一個高度可擴充和成本效益高的工具，用于詳細的單細胞分析。進一步的研究可集中在提高這種技術的分辨率或效率上，以便于在生物醫學研究中的更廣泛應用，例如在更複雜或多樣化的組織類型中。
對線粒體疾病和衰老的影響研究表明，異質性水準在許多神經退行性疾病或代謝障礙等線粒體功能障礙是關鍵因素的疾病中可能是關鍵的。未來的研究可将特定的異質性變化模式與疾病進展或結果聯系起來，可能産生針對性的治療方法。
環境與遺傳選擇的互動作用該研究還強調細胞環境如何顯著影響對mtDNA變體的選擇壓力。遺傳特征與環境條件之間的這種互相作用為研究環境或治療手段如何有益地調節這些動态提供了研究路徑。
在研究和治療中使用mtDNA編輯随着CRISPR-free mtDNA堿基編輯等工具的使用，有潛力直接操縱線粒體遺傳學。未來的方向可能包括開發更精确的編輯工具或方法，這些工具或方法可以安全地應用于臨床環境中，以糾正病理性mtDNA突變。
原文連結
Kotrys AV, Durham TJ, Guo XA, Vantaku VR, Parangi S, Mootha VK. Single-cell analysis reveals context-dependent, cell-level selection of mtDNA. Nature. 2024 Apr 24. doi: 10.1038/s41586-024-07332-0. Epub ahead of print. PMID: 38658765.
https://www.nature.com/articles/s41586-024-07332-0
責編|探索君
排版|探索君
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