大家好，今天推送的文章是2022年11月發表在 Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications 上的 The structure of His-tagged Geobacillus stearothermophilus purine nucleoside phosphorylase reveals a ‘spanner in the works’，通訊作者為紐西蘭坎特伯雷大學實體與化學科學學院生物分子互相作用中心的 Jodie M. Johnston。
嘌呤核苷磷酸化酶 (PNPase) 是存在于某些生物體中的嘌呤補救途徑中的一種酶，該酶對核苷進行可逆磷酸解，形成核糖 1-磷酸和嘌呤堿基（圖 1）。PNPase 有兩種主要結構形式：主要存在于真核生物中的三聚體形式和主要存在于細菌中的六聚體形式（‘trimer-of-dimers’）。PNPase 的三聚體和六聚體形式具有相似的亞基結構，即 α/β折疊，它們主要差別在于底物特異性，大多數研究的三聚 PNPase 底物僅限于 6-氧代嘌呤核糖核苷，而六聚 PNPase 可以使用 6-氧代嘌呤核糖核苷和 6-氨基嘌呤核糖核苷作為底物。雖然六聚體形式主要存在于細菌中，但許多細菌的基因組中都編碼了這兩種形式，包括嗜熱脂肪地芽孢杆菌，它是一種革蘭氏陽性嗜熱細菌，也是食品腐敗的常見原因。
PNPase 是潛在的抗菌藥物靶标和生産抗病毒核苷化合物的工業催化劑。PNPase 的底物混雜性與後一種應用相關，因為 PNPase 可以容納的嘌呤堿基範圍越廣，它可用于生産的抗病毒核苷候選物的範圍就越廣。由于許多潛在的嘌呤堿基在環境溫度下的溶解度有限，來自嗜熱生物體（例如嗜熱脂肪芽孢杆菌）的 PNPase 可以在更高的溫度下使用，進而提高底物溶解度，進而允許生産這些化合物的範圍更廣。本文作者以 1.72 Å的分辨率解析了嗜熱脂肪芽孢杆菌 N 末端 His 标記的 PNPase (His-GsePNPase) 的結構。
圖1
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His-GsePNPase 的結構
His-GsePNPase 在沒有配體的情況下在空間群 P43212中結晶，衍射分辨率為 1.72 Å。不對稱單元中存在三個鍊（a-c），可以通過應用晶體學對稱操作從中生成六聚體生物組裝體（圖2a）。六聚體結構通過環形六聚體顯示出三重對稱性，His-GsePNPase 可以被視為二聚體的三聚體（a/b、a0/b0 和 c/c0），與其他六聚體 PNPase 一樣。除了鍊 c 中的殘基 209-210 和 N 端标簽的部分之外，觀察到的每條鍊的電子密度都是連續的。
亞基折疊分析表明 HisGsePNPase 在結構上與其他六聚體 PNPase 相似， His-GsePNPase 亞基結構具有保守的折疊，其結構最類似于幽門螺杆菌 PNPase和經過充分研究的 EcPNPase，均方根标準差 (r.m.s.d.) 為 0.42–0.51 Å。HisGsePNPase 的亞基彼此相似，成對比較的 r.m.s.d. 為 0.136–0.160 Å。每個亞基由七個β-螺旋（H1-H7）和兩個β-折疊組成（圖2b）。第一個 β-片層 (S1–S4) 有四條鍊，其中 S3 反平行，并且第二片形成片狀桶卷（S5-S10），其中S5和S10反平行。根據 SCOP 中的分析，HisGsePNPase 是磷酸化酶/水解酶樣折疊超家族的一部分，其他 PNPase 也是如此。
圖 2
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His-GsePNPase 和 EcPNPase
活性位點之間的高度保守性
PNPase 活性位點形成于兩個亞基（例如亞基 a 和 b；圖 3a）之間的界面附近，并且六聚體中有六個活性位點。活性位點主要由一個亞基的殘基形成，每個二聚體對中的另一個亞基的殘基也有貢獻（圖3b）。EcPNPase 和 HisGsePNPase 的活性位點之間具有高度的序列和結構保守性。在 EcPNPase 中，與嘌呤堿基互相作用的殘基被鑒定為 Ala156、Phe159、Val178、Met180、Asp204 和 Ile206，它們相當于His-GsePNPase 中的 Ala156、Phe159、V al177、Met179、Asp203 和 Ile205 （圖3b）。EcPNPase 中的核糖結合位點主要是通過與一個亞基的 Glu181 和相鄰亞基的 His4 互相作用形成的，它們分别相當于 His-GsePNPase 中的 Glu180 和 His4（圖 3b）。EcPNPase 的磷酸結合位點由兩個精氨酸殘基組成，一個亞基的 Arg87 和相鄰亞基的 Arg43，這些殘基在 HisGsePNPase 中也是保守的（圖 3b）。
圖 3
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相鄰亞基的 N 端标簽占據活性位點
關于 His-GsePNPase 結構的一個令人驚訝的方面是，活性位點中存在來自九個殘基 rTEV 位點 (ENLYFQGAM) 的幾個殘基 (NLYFQ) N 末端标簽。觀察到 rTEV 位點的這一部分與每個二聚體中相鄰亞基的活性位點結合（圖 3a）。活性位點和 N 端标簽之間的互相作用由 rTEV 識别位點中的 Tyr 殘基主導。該殘基的定向方式與底物的嘌呤堿部分類似（圖3c）。這種結合姿勢的相似性表明，該殘基與活性位點殘基産生的疏水性堆積互相作用可能有助于将 N 端标簽保持在與活性位點結合的位置，是以也可能阻止蛋白酶對序列中 Gln 和 Gly 之間的切割。
N 末端标簽占用會阻止 His-GsePNPase 活性位點關閉，其特征是具有 α 螺旋（H7，使用 EcPNPase 的 α 螺旋編号），該結構可以分割成兩部分以封閉活性位點。在 His-GsePNPase H7 中，由殘基 V al200-Gln217 組成。在 EcPNPase 中觀察到兩種不同的活性位點構象，表示為“開放”（非分段形式）和“閉合”（分段形式）。在閉合構象中，該環消除了對活性位點的通路。在His-GsePNPase的結構中，所有三個亞基中該環的構象與EcPNPase“開放”構象最一緻（圖3d），标簽占據活性位點，排除了螺旋分段并采用“閉合”構象的能力。
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N 端标簽與活性位點的互相作用可能
會影響酶功能
在考慮 N 端标簽在活性位點結合的功能影響之前，首先有必要研究這是否隻是由鄰近效應和熵驅動的結晶假象。是以作者團隊嘗試裂解标簽并純化未标記的形式，以期對标記和未标記的形式進行聯合結構和功能表征。然而，無論實驗條件如何，僅獲得了切割和未切割亞基的混合群體，其中主要是未切割的。該結果表明标簽可能難以去除，因為 His-GsePNPase 在溶液中以标簽結合形式存在，阻止了蛋白酶到達切割位點。在高濃度 PNPase 抑制劑阿昔洛韋和底物 7-甲基鳥嘌呤存在下進行的結晶篩選實驗，其結果支援了标簽對結晶形式的活性位點的強親和力，這表明兩種底物都不能取代來自活動位點的标簽。然而紫外-可見光活性測定結果表明 N 末端标記的 His-GsePNPase 在溶液中具有催化活性（資料未顯示）。酶活性意味着在标準測定條件下，活性位點必須至少在某種程度上可接近底物。雖然底物可以與标簽競争溶液中的活性位點結合，但反之亦然，即标簽可能與底物競争，可能影響酶的活性。
綜上所述，表明 His-GsePNPase 最有可能以标簽結合形式存在于溶液相和結晶相中，但由于無序未結合形式的熵有利性部分抵消了結合，是以在溶液中具有較低的親和力焓。這種情況，加上溶液中蛋白質的動态特性，可以解釋為什麼在活性測定中觀察到底物結合，但在結晶篩選中觀察不到。
本文作者團隊以 1.72 Å的分辨率解析了來自嗜熱脂肪地芽孢杆菌的嘌呤核苷磷酸化酶結構。重組煙草蝕紋病毒蛋白酶 (rTEV) N 端标簽切割位點的幾個殘基位于二聚體中相鄰亞基的活性位點中，這種互相作用的關鍵殘基是酪氨酸殘基，它位于底物核苷環通常所在的位置。标簽結合似乎是由焓效應、熵效應和鄰近效應的組合驅動的，嘗試在溶液中切割标簽僅産生一小部分未标記的蛋白質，這表明該酶主要以标簽結合形式存在于溶液中，進而阻止 rTEV 進入切割位點。然而标記的蛋白質在溶液中保留了一些活性，表明該标記并未完全阻斷活性位點，但可能充當競争性抑制劑。
該文章啟發我們應謹慎确定親和标簽如何影響蛋白質結構和功能，特别是對于标簽去除困難的情況。
文章資訊：
https://doi.org/10.1107/S2053230X22011025