大家好，今天推送的文章是2022年11月发表在 Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications 上的 The structure of His-tagged Geobacillus stearothermophilus purine nucleoside phosphorylase reveals a ‘spanner in the works’，通讯作者为新西兰坎特伯雷大学物理与化学科学学院生物分子相互作用中心的 Jodie M. Johnston。
嘌呤核苷磷酸化酶 (PNPase) 是存在于某些生物体中的嘌呤补救途径中的一种酶，该酶对核苷进行可逆磷酸解，形成核糖 1-磷酸和嘌呤碱基（图 1）。PNPase 有两种主要结构形式：主要存在于真核生物中的三聚体形式和主要存在于细菌中的六聚体形式（‘trimer-of-dimers’）。PNPase 的三聚体和六聚体形式具有相似的亚基结构，即 α/β折叠，它们主要区别在于底物特异性，大多数研究的三聚 PNPase 底物仅限于 6-氧代嘌呤核糖核苷，而六聚 PNPase 可以使用 6-氧代嘌呤核糖核苷和 6-氨基嘌呤核糖核苷作为底物。虽然六聚体形式主要存在于细菌中，但许多细菌的基因组中都编码了这两种形式，包括嗜热脂肪地芽孢杆菌，它是一种革兰氏阳性嗜热细菌，也是食品腐败的常见原因。
PNPase 是潜在的抗菌药物靶标和生产抗病毒核苷化合物的工业催化剂。PNPase 的底物混杂性与后一种应用相关，因为 PNPase 可以容纳的嘌呤碱基范围越广，它可用于生产的抗病毒核苷候选物的范围就越广。由于许多潜在的嘌呤碱基在环境温度下的溶解度有限，来自嗜热生物体（例如嗜热脂肪芽孢杆菌）的 PNPase 可以在更高的温度下使用，从而提高底物溶解度，从而允许生产这些化合物的范围更广。本文作者以 1.72 Å的分辨率解析了嗜热脂肪芽孢杆菌 N 末端 His 标记的 PNPase (His-GsePNPase) 的结构。
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His-GsePNPase 的结构
His-GsePNPase 在没有配体的情况下在空间群 P43212中结晶，衍射分辨率为 1.72 Å。不对称单元中存在三个链（a-c），可以通过应用晶体学对称操作从中生成六聚体生物组装体（图2a）。六聚体结构通过环形六聚体显示出三重对称性，His-GsePNPase 可以被视为二聚体的三聚体（a/b、a0/b0 和 c/c0），与其他六聚体 PNPase 一样。除了链 c 中的残基 209-210 和 N 端标签的部分之外，观察到的每条链的电子密度都是连续的。
亚基折叠分析表明 HisGsePNPase 在结构上与其他六聚体 PNPase 相似， His-GsePNPase 亚基结构具有保守的折叠，其结构最类似于幽门螺杆菌 PNPase和经过充分研究的 EcPNPase，均方根标准差 (r.m.s.d.) 为 0.42–0.51 Å。HisGsePNPase 的亚基彼此相似，成对比较的 r.m.s.d. 为 0.136–0.160 Å。每个亚基由七个β-螺旋（H1-H7）和两个β-折叠组成（图2b）。第一个 β-片层 (S1–S4) 有四条链，其中 S3 反平行，并且第二片形成片状桶卷（S5-S10），其中S5和S10反平行。根据 SCOP 中的分析，HisGsePNPase 是磷酸化酶/水解酶样折叠超家族的一部分，其他 PNPase 也是如此。
图 2
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His-GsePNPase 和 EcPNPase
活性位点之间的高度保守性
PNPase 活性位点形成于两个亚基（例如亚基 a 和 b；图 3a）之间的界面附近，并且六聚体中有六个活性位点。活性位点主要由一个亚基的残基形成，每个二聚体对中的另一个亚基的残基也有贡献（图3b）。EcPNPase 和 HisGsePNPase 的活性位点之间具有高度的序列和结构保守性。在 EcPNPase 中，与嘌呤碱基相互作用的残基被鉴定为 Ala156、Phe159、Val178、Met180、Asp204 和 Ile206，它们相当于His-GsePNPase 中的 Ala156、Phe159、V al177、Met179、Asp203 和 Ile205 （图3b）。EcPNPase 中的核糖结合位点主要是通过与一个亚基的 Glu181 和相邻亚基的 His4 相互作用形成的，它们分别相当于 His-GsePNPase 中的 Glu180 和 His4（图 3b）。EcPNPase 的磷酸结合位点由两个精氨酸残基组成，一个亚基的 Arg87 和相邻亚基的 Arg43，这些残基在 HisGsePNPase 中也是保守的（图 3b）。
图 3
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相邻亚基的 N 端标签占据活性位点
关于 His-GsePNPase 结构的一个令人惊讶的方面是，活性位点中存在来自九个残基 rTEV 位点 (ENLYFQGAM) 的几个残基 (NLYFQ) N 末端标签。观察到 rTEV 位点的这一部分与每个二聚体中相邻亚基的活性位点结合（图 3a）。活性位点和 N 端标签之间的相互作用由 rTEV 识别位点中的 Tyr 残基主导。该残基的定向方式与底物的嘌呤碱部分类似（图3c）。这种结合姿势的相似性表明，该残基与活性位点残基产生的疏水性堆积相互作用可能有助于将 N 端标签保持在与活性位点结合的位置，因此也可能阻止蛋白酶对序列中 Gln 和 Gly 之间的切割。
N 末端标签占用会阻止 His-GsePNPase 活性位点关闭，其特征是具有 α 螺旋（H7，使用 EcPNPase 的 α 螺旋编号），该结构可以分割成两部分以封闭活性位点。在 His-GsePNPase H7 中，由残基 V al200-Gln217 组成。在 EcPNPase 中观察到两种不同的活性位点构象，表示为“开放”（非分段形式）和“闭合”（分段形式）。在闭合构象中，该环消除了对活性位点的访问。在His-GsePNPase的结构中，所有三个亚基中该环的构象与EcPNPase“开放”构象最一致（图3d），标签占据活性位点，排除了螺旋分段并采用“闭合”构象的能力。
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N 端标签与活性位点的相互作用可能
会影响酶功能
在考虑 N 端标签在活性位点结合的功能影响之前，首先有必要研究这是否只是由邻近效应和熵驱动的结晶假象。因此作者团队尝试裂解标签并纯化未标记的形式，以期对标记和未标记的形式进行联合结构和功能表征。然而，无论实验条件如何，仅获得了切割和未切割亚基的混合群体，其中主要是未切割的。该结果表明标签可能难以去除，因为 His-GsePNPase 在溶液中以标签结合形式存在，阻止了蛋白酶到达切割位点。在高浓度 PNPase 抑制剂阿昔洛韦和底物 7-甲基鸟嘌呤存在下进行的结晶筛选实验，其结果支持了标签对结晶形式的活性位点的强亲和力，这表明两种底物都不能取代来自活动位点的标签。然而紫外-可见光活性测定结果表明 N 末端标记的 His-GsePNPase 在溶液中具有催化活性（数据未显示）。酶活性意味着在标准测定条件下，活性位点必须至少在某种程度上可接近底物。虽然底物可以与标签竞争溶液中的活性位点结合，但反之亦然，即标签可能与底物竞争，可能影响酶的活性。
综上所述，表明 His-GsePNPase 最有可能以标签结合形式存在于溶液相和结晶相中，但由于无序未结合形式的熵有利性部分抵消了结合，因此在溶液中具有较低的亲和力焓。这种情况，加上溶液中蛋白质的动态特性，可以解释为什么在活性测定中观察到底物结合，但在结晶筛选中观察不到。
本文作者团队以 1.72 Å的分辨率解析了来自嗜热脂肪地芽孢杆菌的嘌呤核苷磷酸化酶结构。重组烟草蚀纹病毒蛋白酶 (rTEV) N 端标签切割位点的几个残基位于二聚体中相邻亚基的活性位点中，这种相互作用的关键残基是酪氨酸残基，它位于底物核苷环通常所在的位置。标签结合似乎是由焓效应、熵效应和邻近效应的组合驱动的，尝试在溶液中切割标签仅产生一小部分未标记的蛋白质，这表明该酶主要以标签结合形式存在于溶液中，从而阻止 rTEV 进入切割位点。然而标记的蛋白质在溶液中保留了一些活性，表明该标记并未完全阻断活性位点，但可能充当竞争性抑制剂。
该文章启发我们应谨慎确定亲和标签如何影响蛋白质结构和功能，特别是对于标签去除困难的情况。
文章信息：
https://doi.org/10.1107/S2053230X22011025