文|胡叁叔
編輯|胡叁叔
前言
轉錄因子作為一類能夠特異地與順式分子互相作用的蛋白，在植物生長發育、形态建成和逆境脅迫應答等方面發揮重要功能。
NAC轉錄因子是一類廣泛存在于植物中的重要轉錄調節蛋白，通過與NACRS啟動子互相作用，調節下遊基因的表達。
NAC類轉錄因子在植物生長發育中起着非常關鍵的調節功能，它在種子發育、次生細胞壁形成、側根發育、葉片衰老、果實成熟和色澤形成等方面起到了非常關鍵的調節作用。
前期工作發現，NAC轉錄因子在香蕉、柿子、枇杷、蘋果、桃、荔枝、猕猴桃、鳳梨等水果中具有重要的調控作用。
鳳梨又稱“樹上鳳梨”，因其果實甘美甜美而被稱為“赤道蘋果”，是一種極具開發和利用價值的“赤道蘋果”。
鳳梨蜜是一種具有呼吸變化特性的果品，采摘後極易發生腐敗，難以長期儲存，是以提高其采後保存期限具有十分重要的意義。
NAC類轉錄因子是調節水果成熟程序的重要轉錄因子，但其在鳳梨中的研究還未見報道。
是以，我們拟通過RT-PCR、Real-timeqPCR等方法，對3個NAC家族成員進行功能分析，明确NAC家族成員在鳳梨蜜采後老化過程中的功能，進而闡明NAC家族成員在鳳梨蜜采後老化過程中的功能，為深入了解鳳梨蜜的成熟機制及貯藏技術奠定基礎。
材料與方法
本研究選用香味馥郁的“海大2号”鳳梨為試材。在盛花期選擇同一花期，生長良好的品種進行挂号，開花後150天左右收獲，采集後及時送至化驗室，選取無病害、無蟲、無成熟度相近的品種，分成3個組别。
第1組以正常生長期為對照；随後将第2組以1000mg.L-1的乙烯利液将水果浸水2-3分鐘後取下曬幹；之後對第3組的果肉進行0.5mg.L1-甲基環丙烯熏蒸處理，持續17小時。
3個品種全部置于室溫（22±1)，相對濕度為90%。按各處理的成熟度進行采樣，分别為：對照組每日采樣；以0.5天為間隔，對ETH處理的組行采樣；1-MCP處理後分别于0,4,8,10,12,14,16天采血。
每個水果3-5個，将鳳梨蜜的果肉分開，然後将其切割為5mmx5mmx5mm的小塊，按照1/4的比例采樣，攪拌均勻，液氮冷凍，儲存在-80℃的超低溫冷藏室中。
利用TaKaRacDNAsynthesis技術以鳳梨蜜為研究對象，通過RacDNAsynthesis技術，反向表達鳳梨蜜的cDNA。
采用50µL聚合酶鍊反應系統，對“海大2”鳳梨蜜的cDNA進行PCR擴增，PCR的擴增順序為：94℃3分鐘、94℃30秒、55℃30秒、72℃1分鐘，35次周期後，72℃10分鐘。
擴增PCR産物進行凝膠電泳檢測，切膠回收，連接配接pMD20-T、pMD19-T載體并轉化大腸杆菌DH5α，菌液檢測後測序。
利用聯機分析軟體ProtParamtool對鳳梨NAC基因編碼的蛋白質進行了基礎實體化學特性的研究。
再利用SignalP4.1伺服器及TMHMM技術，對NAC基因的轉錄因子進行了研究，确定了NAC基因的轉錄因子。
亞細胞位置的預測采用軟貝葉斯蛋白；利用NetPhos3.1伺服器及DictyOGlyc1.1伺服器分别對NAC基因的磷酸化及糖基化位點進行了分析。
采用Clustalx和GENEDOC對NAC的多個配對進行了比較；利用近鄰方法在MEGA7.0中建立了進化樹。
本項目拟以NAC為研究對象，采用Pfam34.0資料庫和MEME技術對NAC的功能進行深入研究，并對NAC的功能進行鑒定。
以AheGAPDH為參考，利用Primer5.0對該基因的非保守區域進行設計，利用Oligo6.0對其進行驗證，最終将合格引物送出至生工上海公司進行合成。
結果與分析
以鳳梨蜜果肉cDNA為模闆，分别使用AheNAC1-for/-rev、AheNAC2-for/-rev和AheNAC3-for/-rev引物，通過RT-PCR擴增、電泳，得到與期望基因碎片長度一緻的目标條帶，選出陽性克隆并對其進行測序。
AheNAC1,2,3個基因的分子量為40.16,38.91,38.86kD，在3種NAC的氨基酸構成中，以Ser為最多，其氨基酸構成為9.7%,10.3%,10.0%，最低為半胱氨酸。
該基因所表達的蛋白質都是親水的，AheNAC1是一個不穩定的酸性蛋白質，而AHeNAC2是一個不穩的堿性蛋白質，AhenAC3是一個不平衡的堿性蛋白質。
通過對三個不同NAC位點的分析，結果表明這三個NAC位點的NAC位點均不含有信号多肽和轉運多肽，是一種不具有分泌性的蛋白質。
通過對三個基因的跨膜區序列進行分析，發現三個基因的跨膜區數量為0，沒有跨膜區，不屬于細胞膜蛋白。
是以，我們發現NAC是一種轉錄因子，通常位于細胞内。
運用SoftBerryProtComp9.0軟體，對3個NAC蛋白展開了亞細胞定位的分析，結果顯示3個NAC蛋白在細胞核上的整體位置為8.61,8.86,9.10，它們在細胞核上的整體位置為8.61,8.86,9.10，它們在質膜和液泡上的分布比較少。
AheNAC3蛋白在膜外和過氧化物酶體上也有少數分布，由此推測NAC蛋白很有可能存在于細胞核上，這表明AheNAC1、AheNAC2和AheNAC3極有可能是在細胞核中起到調節作用的轉錄因子。
糖基化修飾位點的分析顯示，AheNAC1、AheNAC2和AheNAC3分别有1個，2個，2個。
對3種蛋白質進行了磷酸化分析，結果表明3種蛋白質的磷酸化水準分别為46個，38個，53個，并且3種蛋白質有46個磷酸化水準。
而這些磷酸酶通過SOPMA方法對它們的二級結構進行了分析，結果表明AheNAC1、AheNAC2和AheNAC3都包含了α-螺旋、延長鍊、β-轉角和随機卷曲四種成分。
這些成分以随機卷曲為主，并且在全鍊上均勻地分布，然後是α螺旋，并且集中地分布在蛋白質的N端和C端，而β-轉角的成分很低，僅出現在蛋白質的N端。
通過三維結構的模組化，還發現α-螺旋、延長鍊、beta轉角和随機卷曲是3個蛋白質的折疊模式，AheNAC1和AheNAC2的蛋白質三級結構類似，而AheNAC3的蛋白質三級結構與AheNAC1和AheNAC2有很大的不同。
Blastn搜尋結果表明，AheNAC1與枇杷品種EjNAC3的相似度為84.65%，與桃樹品種PpNAC4的相似度為83.9%；AheNAC2與黃棗鋅NAC2的相似度為76.96%，檸條NAC4的相似度為76.75%。
其中AheNAC3與MNAC21的相似度最大，對其序列進行了序列比對，發現AheNAC1、AheNAC2和AheNAC3分别在15-139和16-142個位置上都是NAM的保守區域。
利用Clustalx及GENEDOC等多種方法，我們發現AheNAC在N-末端存在着一個非常保守的N-末端，并可分為A,B,C,D,E5個亞結構域，其中C末端的保守性最小，且很可能與AheNAC的轉錄活化相關。
MEME分析顯示AheNAC蛋白都含有4個保守的模體，它們都位于N端的NAM功能域内，A區域位于Motif3内，B區域位于Motif1和Motif3内，C區域位于Motif1内，而Motif2和Motif4則位于NAC功能域的D和E内。
在此基礎上，我們采用MEGA7.0建立了105個與鳳梨蜜屬植物相關的NAC蛋白質的親緣關系。
通過對三種鳳梨型NACs的相鄰關系分析和前期研究，我們發現鳳梨型NACs分别為NAM、AheNACs和NAPs。
在拟南芥中，3個鳳梨NAC1與ANAC092,AheNAC2與ANAC072,AheNAC3與ANAC025的同源序列比較，其相似性大于90%。
為了探究這3個AheNAC基因與鳳梨蜜果實成熟之間的聯系，使用RT-qPCR方法，對AheNAC1、AheNAC2和AheNAC3在自然成熟、ETH催熟處理和1-MCP處理後的表達進行了分析。
在鳳梨蜜的果肉中，AheNAC1的相對表達量在水果成熟過程中，會随着水果的成熟而出現先升高再降低的現象。
采摘後的第二天，AheNAC1的相對表達量達到了最高值，然後降低了；AheNAC2、AheNAC3的表達則在第一天達到高峰，之後逐漸降低。
在ETH及1-MCP的作用下，AheNAC1及AheNAC3基因在各階段的表達率均呈現出先上升後下降的趨勢，而在各階段的表達率均與正常成熟率相比沒有明顯差别；ETH可顯著下調AheNAC2的表達。
讨論
在前期研究中，我們已從多種水果中克隆了NAC基因，武肖琦等人從水蜜桃中分離得到1條NAC蛋白，該蛋白具有349個氨基酸，全長1050bp。
楊菲穎等從番木瓜中克隆出兩個NAC基因，其全長609bp、805bp、202、268個氨基酸；我們前期已從鳳梨中獲得3個NAC家族成員，編碼349,348和349個氨基酸。
我們前期的工作表明，3種鳳梨NAC蛋白質的次級結構主要是不規則的卷曲，這一點與以往的報道一緻。
李聖龍等人的實驗結果表明，所有的NACs都是親水的，有23種屬于酸性，50種屬于堿性，所有的NACs都分布在細胞核内。
我們前期的實驗結果表明，鳳梨NAC都是親水的，其中AheNAC1為酸，2、3為堿，且亞細胞分布于細胞核内。
楊菲穎等人的實驗結果顯示，NAC沒有跨膜的結構，也沒有信号多肽；譚秦亮等研究發現，鳳梨NAC蛋白存在明顯的跨膜結構，沒有信号肽。
我們前期工作中，通過對3個鳳梨NAC的分析，我們在鳳梨中發現3個鳳梨NAC沒有跨膜區，也沒有信号多肽，這與譚秦亮等人所報道的鳳梨NAC的差異很大，這很可能是由于鳳梨NAC的三個基因在鳳梨中的作用不盡相同。
NAC轉錄因子N-末端由150-160個氨基酸構成，又分為5個與其DNA及蛋白質結合相關的亞結構，然而NAC類轉錄因子C末端為轉錄活化區，其結構與長度存在較大差異，可同時活化或抑制目标基因的表達。
通過對該基因序列的分析，我們發現了一個鳳梨NAC蛋白，其N末端包含一個NAM的保守區，5個亞區域A~E；C末端具有較強的多樣性，提示其具有多種功能，這一點與以往的報道相吻合。
譚秦亮等前期研究表明，在早、遲兩個成熟階段，鳳梨AcoNAC1的表達量總體上都有所降低，說明AcoNAC1在鳳梨的成熟期表現出了某種負性調節功能。
武肖琦等人的前期工作發現，PpNAC72基因在桃子中的表達率很高，并且在桃子的成熟期呈上升趨勢。
我們前期的工作表明，AheNAC1和AheNAC2與正向調節植物早衰的ANAC092具有較高的親緣關系，超表達ANAC092可加速植物早衰，且其在植物早衰過程中表現出較高的表達率，超表達ANAC072可加速植物早衰。
參考文獻：
［1］王文球《miR164-NAC介導的猕猴桃果實采後成熟的調控機制研究》
［2］譚秦亮，蔡元保，楊祥燕，等《鳳梨NAC轉錄因子基因AcoNAC1生物資訊學及表達分析》
［3］毛琪，葉春海，李映志，等《鳳梨蜜研究進展》
［4］王俊甯，馬靜，豐鋒，等《乙烯對采後鳳梨蜜果實碳水化合物代謝及其酶活性的影響》