文|胡叁叔
編輯|胡叁叔
前言
磷是生物賴以生存的重要物質基礎，同時也是普遍存在的養分制約因素。
它在作物中的比例僅次于N、K，然而，全球大多數耕地都存在磷素不足的問題。
在全球13.19億hm2的土地上，近43%的土地存在磷素缺乏現象，而中國近2/3的土地存在土壤磷素缺乏現象。
目前，大陸農業生産普遍缺乏有效的磷肥，如何有效地促進農業生産，是目前急需解決的科學問題。
應從以下三個角度來改善農業生産問題：一是施用磷肥，以增加農業生産中的磷素。
第二種是以解磷細菌為原料，通過解磷細菌的研究，為開發解磷化肥打下堅實的理論和實踐基礎。第三個是如何培育出對土壤中磷素具有較高吸收和利用的磷素能力植物新品種。
盡管磷肥的施用，在某種意義上可以改善大陸廣大地區土壤中缺乏高效磷的狀況，然而，大量的磷肥進入到農田後，會以更快的速度轉變為鈣化态和閉儲态。
同時，随着對磷肥的不斷需求，現有的磷礦石也越來越緊缺。
本項目的實施對于進一步提升大陸農田對磷肥的使用率，開發高品質的解磷菌以及選育磷高效農作物新品種，都有着重要的理論和實踐價值。
土壤微生物是最大、最豐富、最具營養價值的一類生物，它能夠将有機磷轉變為可被作物利用的無機磷，被稱作“解磷菌”。
解磷菌不僅種類繁多，而且在自然界中數量也十分龐大，是一項非常值得開發研究的資源。1903年，STALSTROM等人首次報道了能解磷的細菌、真菌、放線菌和藍藻等多種生物。
在全球範圍内，使用最早和最廣的解磷微生物是巨型芽孢杆菌。在随後的研究中，各種芽孢杆菌、假單胞菌和一些杆菌及部分真菌也被開發為菌劑菌肥，它們在生物化肥的生産中被大量使用。
南京農大資源與環境系，選育出了一個磷效率極高的轉基因水稻OsPT4，該材料通過将OsPT4高親和力的磷素轉運體，轉化到受體體内，進而得到磷效率極高的轉基因水稻。
OsPT4是一類具有較強生物活性的磷素轉運體，能夠促進植物對磷素的吸收和利用。基于以上結果，研發解磷菌促進土壤中有機磷的水解，能否提高其對磷的使用率？
是以，本項目以OsPT4為對象，采用改進的蒙金娜篩選技術，從OspT4的根際土層中篩選出一種能夠有效降解有機磷的細菌。
首先對該細菌的降解性能及溶解磷特征進行分析，再将該細菌與正常農田中已得到的解磷菌進行對比分析，進而确定該細菌在植物中的應用潛力。
材料與方法
磷素高效基因型的連作試驗拟于2014年，地點為中國科學院生态環境科學觀測站。
先将1.0g的根際土樣本放入9mL的滅菌水中，進行漩渦混合30秒，放置10分鐘。
已培育好的1mL細菌溶液，以10-1~10-6的順序，将其塗覆于蒙金娜的固态培養基上，每一種培養基為3種。
經過30℃恒溫孵育5天後，以10-5為适宜濃度。根據以上方式以及最優的稀釋倍數，從土壤樣本中分離出有機磷細菌。
挑選出能夠生成解磷圈的單個細菌，經過劃線純化3~5代，進而得到純細菌，并将其放入LB培養基中進行擴增，之後再用甘油法進行儲存。
用蒙金娜固态、有機磷酸根作為菌種，在30℃下進行3天的固定培養，通過對菌落的形态學分析，根據《常見細菌系統鑒定手冊》中的内容，對其進行了初步的鑒别。
通過測量細菌的群落大小及解磷環大小，得出細菌溶解度名額，并對細菌的解磷性能進行了初步評價。溶解度的計算公式是：可溶性指數=溶磷圈直徑/菌落直徑。
結果與分析
利用蒙金娜固态有機磷發酵液，從OsPT4的根際土中篩選15種可降解有機磷解毒菌。通過三代的純化和發酵，得到6株具有良好解磷性和穩定性的細菌（圖1b）。
對6種有機磷菌進行形貌、大小、顔色觀測和記錄，并對6種有機磷菌進行分析，結果表明6種有機磷菌都屬于革蘭氏陰性（表1）。
細菌的解磷性能通常以溶解度、24小時解磷率等名額來評價。
從可溶性指數看出，6種解有機磷菌株的解磷能力各不相同，從大到小的順序是：Y7>Y11>Y1>Y13>Y4>Y6，其中Y7菌株的可溶性指數為6.33，Y11為3.81（表2）。
此外，還對6株解有機磷菌株的解磷能力展開了定量研究，發現Y7在培養24h後菌液中的無機磷濃度為87.43mgL(1圖2)，與其它5個菌株相比明顯偏高。
在經過24小時的培養之後，每一種菌液的pH都出現了明顯的下降，并且呈現出了酸性，其中Y7菌株的pH下降最明顯，達到了3.42。
在每一種菌株的培養24小時後，菌液pH從大到小的順序是Y11>Y6>Y1>Y13>Y4>Y7（圖3a）。
在培養24小時後結果表明（圖3b)：6株解有機磷菌株，在分泌堿性磷酸酶的能力上有着一些不同。
Y11菌株分泌堿性磷酸酶的能力最強，達到了38.69μgmL-1h-1，第二個是Y7菌株，達到了36.20μgmL-1h-1。根據堿性磷酸酶活性從大到小的順序，Y11>Y7>Y4>Y13>Y6>Y1。
它們的成長過程可以劃分成三個階段，分别是：指數增長、平穩增長和逐漸下降。
在最初的8小時，由于菌落的生長和養分的充足，細菌呈指數倍數迅速生長，8-26小時呈穩定的速率。
在26小時後達到峰值，由于養分的限制，生長速率逐漸降低。Y1和Y4的生長較慢，而Y6、Y7、Y11和Y13的生長速率大緻相同（圖4）。
對16SrDNA的擴增子進行測序（見圖5)，其中6個菌株分别為不動杆菌、假單胞菌、腸杆菌和泛菌屬。
Y6和Y13為腸道杆菌，兩者之間有很大的聯系；Y11與Y4在系統發育上有很大的相似之處，它們屬于一個類群。
解磷細菌是土壤磷素轉化的關鍵驅動因子，它在土壤中的配置設定存在根際效應，并與土壤類型、環境因子、植物種類等多種因子密切相關。
我們前期從OsPT4的根際土中篩選到15個可降解有機磷細菌，其中6個經進一步篩選和純化後，能夠在較高濃度的有機磷環境中穩定地生長，并可産生顯著的“透明圓環”。
前期工作表明，初步篩選獲得的具有解磷功能的細菌，在後期分離中會喪失解磷功能，這與細菌的生長适應及對磷的需求有關。
除此之外，6種細菌的生長特征和活力都沒有太大的變化，它們生長曲線都與微生物培養特征相吻合。
在各種環境中，各細菌對磷酸鹽的溶解性能存在差别，各細菌對磷酸鹽的溶解性能也不盡一緻。
目前，有關解磷菌對磷的解離機理已被證明為兩種：一種是某些細菌能夠通過釋放有機酸、硫化物和H+等酸來降低其所處的環境pH值，進而将其分解成不溶于水的磷酸根。
二是某些細菌在受磷脅迫的條件下，會産生一種能分解有機磷胞外磷酸鹽的溶解酶。
在對培養24h後菌液的pH和ALP活力進行檢測可以看出，Y7菌株的解磷機理主要為酸化作用和ALP作用。
Y11菌株解磷的主要機理是ALP作用，而其它菌株在分泌ALP活力方面沒有明顯的差别，pH下降量與解磷能力存在一定的相關性。
農田土壤中普遍存在的解磷菌包括：芽孢杆菌、不動杆菌、假單胞菌、埃希氏菌、歐文氏菌、沙雷氏菌、腸道杆菌等。
本課題組前期從OsPT4根際土壤中，分離到6個能有效降解有機磷的細菌，其中Y1為不動杆菌，Y6、Y13為腸道杆菌屬，Y4、Y11為Pseudomonaspyloris，Y1為Pacnes。
盡管從水稻土中分離到的新型解磷菌（Y7）還未見報道，但已知其在自然界中普遍存在，并被用于水稻、大麥、蘿蔔等農田栽培。
結語
本研究從含磷效率基因的水稻根際土層中，篩選到15個能分解有機磷的細菌，得到6個能分解出清晰圓環的細菌。
研究發現，6個菌株的解磷性能，與田間已知的幾個解磷菌相近，以Y7為代表，溶解度最高，24小時可分解出87.43mgL-1，是一種具有較強解磷潛力的新菌種。
其中，Y7為水稻籽粒中最常用的一類植物内生真菌，其解磷機理以酸化堿基分解為主。
此外，施用磷高效基因型水稻，能否調控土壤中的解磷細菌種群組成，進而提高土壤的種群數量，可以利用現代分子生物學手段深入探讨。
參考文獻：
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