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文 |周尋渺
編輯 | 周尋渺
前言
喀麥隆棉田地區大豆共生根瘤菌的多樣性，以制定最有效的優良接種劑，促進棉花和大豆的産量增長。是以，從耶麥培養基上分離并形态、生理和生化地對大豆共生根瘤菌進行了表征。針對所使用的兩個大豆品種（Houla1和TGX1910 14F），試驗在喀麥隆北部的兩個IRAD田地（Sanguere-Paul）和遠北地區（Soukoundou）分别布置，采用完全随機完全區組設計，分别用孤立物種制劑進行處理。
根瘤菌接種劑的制備
從六個孤立菌株（IS1、IS2、IS3、IS4、IS5、IS6）中制備出七種液體接種劑，發現它們屬于同一緩慢生長的根瘤菌群，對溫度、pH和鹽度具有高度的耐受性，在28℃、pH（7-9）和鹽度（1%-5%）條件下具有最佳生長。預料之中，接種和未接種的大豆植株都形成了根瘤。
在結瘤方面，IS6孤立菌株與TGX1910 14F品種的大豆間形成的共生關系最為高效，在Sanguere-Paul地區，IS5孤立菌株與Houla1品種的大豆形成了最佳結瘤關系。而在Soukoundou地區，IS6與TGX1910 14F品種相關聯，Houla 1品種與當地的根瘤菌孤立物種相關。目前結果表明，根瘤菌孤立物種在特定的大豆品種和特定的棉田地區具有适應性。這些發現應考慮在商業接種劑制劑中加以考慮。
生物多樣性指的是生态系統、物種以及遺傳多樣性的多樣性。在同一物種的個體之間，存在多個基因的不同表達，促使多種生命形态、表型、生理和生物特征的出現。除了與細菌分類學相關的特定問題外，通常需要鑒定和區分細菌菌株，以探索它們在研究現場的豐富性，以及它們的功能，如解毒、硝化、共生固氮或代謝産物的産生。
随着細菌分類學的進展，已經明确，一種寄主植物可以與多種微生物共生體建立共生關系。就大豆而言，這種寄主植物可以與多達六種根瘤菌孤立物種結瘤，分屬于三個不同的屬，即Bradyrhizobium（japonicum、elkanii、liaoningense）、Sinorhizobium（fredii、xinjiangensis）和Mezorhibium tianshanense。據報道，大豆不僅與緩慢生長的根瘤菌（Bradyrhizobium spp.）建立共生關系，還與快速生長的根瘤菌（Ensifer fredii/Rhizobium tropici）建立共生關系。
為了接種的成功，接種劑的品質，包括細菌共生體的競争能力以及寄主-根瘤菌伴侶之間的特異性，是推動因素。将作物豆科植物接種微生物共生體，适應環境條件，似乎是一種促進氮固定和作物豆科植物生長改善的有效方法。是以，孤立和表征本地根瘤菌菌株是朝着更好地利用它們以改善田間實驗監測的重要一步。
為了解決這個問題，假設喀麥隆北部棉田地區具有根瘤菌多樣性，以促進寄主大豆的産量提高，以及為棉花種植提供氮肥的土壤肥力。北喀麥隆的棉田地區以蘇丹氣候類型為特征（降水為1200毫米，溫度為28℃，蒸發蒸騰為每月168毫米，年光照為2800小時，種植周期為175天），包括圖博羅和加魯阿地區的南部。在北部，屬于吉德和馬魯阿地區，主要是蘇丹-撒哈拉氣候類型（降水量為700 - 850毫米，溫度為27℃ - 28℃，蒸發蒸騰為每月173毫米，年光照為2800小時，種植周期為130天）。
生物材料和接種劑制劑
在盆栽試驗中用于捕獲根瘤菌的土壤取樣于北喀麥隆的四個棉田地區，分别代表了圖博羅、加魯阿、吉德和馬魯阿的田地。分别在馬魯阿地區的Yagoua、Mouhour、kodeck、Zibou，吉德地區的Soukoundou、Sorawel、Doundehi，加魯阿地區的Gashiga、Adoumri、Pitoa、Sanguere-Paul，圖博羅地區的Touboro、Ouro-Barka、Vogzom、Sackdje采集了總共15個土壤樣品。
相同地區的土壤樣品混合成一個複合樣品。通過在盆中播種大豆種子并讓植物生長，從複合土壤中捕獲根瘤菌。在播種後45天，取下植物，選擇有效的結瘤作為根瘤菌的分離物[7]。從幹燥的根瘤中分離出根瘤菌，使用了由酵母提取物制成的YEMA（酵母提取物甘露醇瓊脂）培養基，該培養基的成分如下：10克甘露醇；0.2克硫酸鎂七水合物；1克酵母提取物；0.5克KH2PO4/K2HPO4；0.1克氯化鈉；pH = 6.8。
培養基中添加了0.25%的剛果紅以限制可能的污染物。根瘤的滅菌和研磨後，将磨糊塗布在無菌培養皿中，使用無菌細胞外殼，取糊液的小部分，并無菌地塗布在YEMA固體培養基上。接種的培養皿在28℃±2℃的溫度下培養。
在第一次劃線後的三天，分别生長的不同菌落在相同條件下接種到YEMA-Congo Red固體培養基上，以篩選所有的單菌落。亞博在次培養後的三天，在研究其生理和生化特征之前，描述了孤立菌落的形态文化特征。
在黑暗中，将分别培養在28℃±2℃的YEMA生長培養基上的不同典型菌落孵育3天後，進行了鑒定、計數并評估其形态特征（形狀、大小、外觀、高度、表面、顔色和邊緣），如所報告。通過剛果紅試驗、溴甲藍藍試驗、革蘭氏染色和光學顯微鏡下的細胞觀察，篩選根瘤菌菌株。
孤立菌株的生理和生化特征測定
孤立的根瘤菌進行了不同脅迫條件下的抗性研究，通過在不同的NaCl濃度（1%、2%、3%、5%和10%）、pH（4、7、8、9、11）和溫度（28℃、30℃、35℃、38℃和42℃）的YEMA培養基上劃線生長。在28℃±2℃的條件下，孤立菌株在YEMA固體培養基上生長3天後，進行了過氧化氫酶試驗，通過在培養物上加入2 - 3滴過氧化氫（3%）來進行。
氣泡的形成表明孤立菌株産生了過氧化氫酶（+）或沒有産生（-）[12]。孤立菌株水解澱粉的能力通過在每個孤立菌株的營養瓊脂培養基平闆上添加0.2%的澱粉粉末來評估。然後将标記的培養皿在28℃±2℃下培養3天，之後通過使用Gram氏碘洗出菌落周圍的澱粉酶産生的氫氧化物，檢測孤立菌株水解澱粉的能力。
記錄孤立菌落周圍的光環的存在（+）或不存在（-）。三糖離子瓊脂試驗在三糖鐵瓊脂培養基上進行，以确定孤立菌株利用不同碳水化合物源進行生長的行為。該試驗用于區分能夠發酵葡萄糖并産生酸和硫化氫的根瘤菌群體。通過在YEMA培養基中添加2%尿素和0.012%酚紅，評估孤立菌株産生氨的能力。在經過過濾的滅菌處理後，将每個孤立物種轉移到固體培養基上，通過劃線法，28℃±2℃孵育3天。初始培養基的顔色從紅色變為粉紅色，表明在堿性環境中發生了尿素的水解（+），形成氨和二氧化碳，而黃色是在酸性環境中發生負反應（-）的迹象。
孤立的根瘤菌菌株的氨産生能力在0.5 mL的肽膜培養基（1 g肽膜、0.5 g氯化鈉、0.5 g硝酸鉀，1000 mL蒸餾水）中進行評估，将其分散在每個标記的試管中，同時設定一個對照。孵育3天後，在每個根瘤菌培養物中加入1 mL Nessler試劑，然後記錄從橙色到棕色的顔色變化，表示存在氨（+）。
孤立的根瘤菌菌株通過管培養進行吲哚乙酸（IAA）的定性分析，在每個培養管中加入50 μg/mL過濾後的色氨酸培養基溶液。在28℃±2℃條件下，對包含不同孤立物種的管進行孵育3天，包括陰性對照，在1 mL上清液中加入4 mL試劑，充分混合溶液，孵育30分鐘，以允許出現粉紅色，表示孤立物種産生IAA（+）。
從盆栽試驗中分離的六株根瘤菌中，制備了七種液體根瘤菌接種劑，分别為S0、IS1、IS2、IS3、IS4、IS5、IS6和M，每種接種劑中平均含有1×109個細胞。
針對每個大豆品種Houla1（V1）和TGX1910 14F（V2），分别設計了一個完全随機區組設計的實驗。每個實驗包括7個處理，分别代表7種根瘤菌接種劑IS0、IS1、IS2、IS3、IS4、IS5、IS6和M。IS0是陰性對照，而M是六種根瘤菌接種劑以等體積混合的混合物。在播種時，接種是将兩顆種子放入一個播種孔中，并用相應的接種劑濕潤。對照組的種子播種不接種。
在播種後35天（花期）和60天（結莢期），從每個進行中随機選擇30棵植株，小心地從土壤中取出，并計數其總根瘤數。評估一個根瘤固定大氣氮的效率是通過使用雷射刀片切割植株的所有根瘤，觀察根瘤血紅蛋白的顔色，它分别表示寄主植物是否固定（綠色）或不固定（白色）大氣氮。根瘤的幹重是通過在電子天平上測量得到的。
使用單因素方差分析（One-way ANOVA）分析了不同處理的效應，以植株重量和根瘤重量為變量。通過STATGRAPHICS 5.0程式使用Duncan多重範圍測試對處理之間的均值進行了排序。
根瘤菌孤立物種的形态特征差異
在28℃的YEMA培養基上培養72小時後，鑒定出16個根瘤菌菌落，根據其形态特征分為6個孤立物種，其中IS1、IS2、IS3和IS4、IS5、IS6分别來自Houa1和TGX 1910 14F的根際（表2）。孤立物種1（IS1）由三個（圓形、透明和凸起）菌落組成，占所有菌落的18.75%。孤立物種2（IS2）由三個（圓形、白色和凸起）菌落組成（18.75%）。
孤立物種3（IS3）由六個菌落（37.5%）圓形、乳白色和凸起組成。孤立物種4（IS4）由兩個菌落（12.5%）卵形、乳白色和凸起組成。孤立物種5（IS5）和6（IS6）分别由一個菌落組成，卵形、黃色、扁平，或圓形、白色、扁平。
在所有已鑒定出的16個菌落中，81.25%為圓形，87.5%為凸起。透明的菌落較少。這些形态特征被稱為生長緩慢的根瘤菌菌落，據報道這些菌落大多呈圓形和凸起，很少呈透明。在YEMA培養基上培養3天後，菌落的平均大小在2到7毫米之間。
目前的菌落大小範圍高于之前的研究結果，之前的研究報告了生長緩慢的根瘤菌菌落在培養3至5天後的大小在1到2毫米之間。六個已鑒定的根瘤菌孤立物種分别在25°C、28°C、30°C和42°C下孵育3天，以測試它們對熱的耐性。
所有的孤立物種在28°C下生長良好，證明了之前的研究結果，表明根瘤菌的最佳生長溫度在25°C - 30°C之間。孤立物種IS1、IS3和IS5在25°C下仍保持了較好的生長，而孤立物種IS2、IS4和IS6的生長稍遜一籌。在28°C以上，根瘤菌孤立物種保持了良好的生長，隻有孤立物種IS4在42°C下生長較弱，與其他結果一緻，一些根瘤菌菌株能夠在40°C - 45°C之間生長。
慢生長的根瘤菌據報道比快生長的根瘤菌更耐高溫。在測試不同pH值下的生長時，未觀察到在pH 3下的生長。雖然所有孤立物種在pH 4下生長良好，但在pH 7下觀察到了所有孤立物種的最大生長，證明了大多數孤立根瘤菌的中性行為。相比之下，據報道在Calycotome spinose根際中發現的根瘤菌的最佳生長pH位于4 - 6.8之間。這些差異不僅可以歸因于孤立物種的内在特性，還可以歸因于環境條件因素。
結論
在對大豆關聯的根瘤菌進行了表征後，從YEMA培養基上的16個純化菌落中鑒定出了6個孤立物種。這些孤立物種被認為無法産生酸，這表明它們是生長緩慢的根瘤菌，可能屬于Bradyrhizobium屬。它們對溫度、pH和不同鹽濃度都具有高度耐受性。共生試驗揭示了高效的根瘤菌-大豆組合，如IS4或IS5與Houla 1品種的組合，而孤立物種IS6是Sanguere-Paul研究站（加魯阿）TGX 1910 14F大豆品種的最佳共生體。
參考文獻
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