一、摘要
實驗旨在了解Chip-seq的基本原理。通過模仿文獻《Targeting super enhancer associated oncogenes in oesophageal squamous cell carcinoma》的流程，學會利用NCBI和EBI資料庫下載下傳資料，熟悉Linux下的基本操作，并使用R語言畫圖，用Python或者shell寫腳本進行基本的資料處理，通過FastQC、Bowtie、Macs、samtools、ROSE等軟體進行資料處理，并對預測結果進行分析讨論。
二、材料
1、硬體平台 處理器:Intel（R） Core（TM）i7-4710MQ CPU @ 2.50GHz 2.50GHz
安裝記憶體(RAM)：16.0GB
2、系統平台 Windows 8.1，Ubuntu
3、軟體平台 ① Aspera connect ② FastQC ③ Bowtie
④ Macs 1.4.2 ⑤ IGV ⑥ ROSE
4、資料庫資源 NCBI資料庫：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/;
EBI資料庫：http://www.ebi.ac.uk/;
5、研究對象 加入H3K27Ac 抗體處理過的TE7細胞系測序資料和其空白對照組
加入H3K27Ac 抗體處理過的KYSE510細胞系和其空白對照組
背景簡介：食管鱗狀細胞癌（OSCC）是一種侵襲性的惡性惡性良性腫瘤，本文章通過高通量小分子抑制劑進行篩選，發現了一個高度有效的抗癌物，特異性的CDK7抑制劑THZ1。RNA-Seq顯示，低劑量THZ1會對一些緻癌基因的産生選擇性抑制作用，而且，對這些THZ1敏感的基因組功能的進一步表征表明他們經常與超級增強子結合（SE）。ChIP-seq解讀在OSCC細胞中，CDK7的抑制作用的機制。
本文亮點：确定了在OSCC細胞中SE的位置，以及識别出許多SE有關的調節元件；并且發現小分子THZ1特異性抑制SE有關的轉錄，顯示強大的抗癌性。
文章PMID: 27196599
三、方法
實驗資料擷取流程如下：
Chip-seq流程報告1、硬體平台2、系統平台3、軟體平台4、資料庫資源5、研究對象1、Aspera軟體下載下傳及安裝2、Chip-Seq資料下載下傳3、FastQC品質檢查4、使用Bowtie對Reads進行Mapping5、MACS尋找Peak富集區6、IGV可視化7、ROSE鑒定Enhancer1、Chip-Seq資料下載下傳2、FastQC品質檢查3、使用Bowtie對Reads進行Mapping4、MACS尋找Peak富集區5、IGV對peaks可視化6、ROSE分析結果1、結論2、讨論 資料分析流程圖如下：
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Chip-seq流程報告1、硬體平台2、系統平台3、軟體平台4、資料庫資源5、研究對象1、Aspera軟體下載下傳及安裝2、Chip-Seq資料下載下傳3、FastQC品質檢查4、使用Bowtie對Reads進行Mapping5、MACS尋找Peak富集區6、IGV可視化7、ROSE鑒定Enhancer1、Chip-Seq資料下載下傳2、FastQC品質檢查3、使用Bowtie對Reads進行Mapping4、MACS尋找Peak富集區5、IGV對peaks可視化6、ROSE分析結果1、結論2、讨論 圖表 1 aspera的下載下傳
Linux下的安裝配置參考博文：
http://blog.csdn.net/likelet/article/details/8226368
2、Chip-Seq資料下載下傳 1）選擇NCBI的GEO DataSets資料庫，輸入GSE76861，打開GSM2039110、GSM2039111、2039112、GSM2039113擷取它們對應的SRX序列号。
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2）進入EBI，擷取ascp下載下傳位址
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3）使用aspera下載下傳并解壓
aspera下載下傳指令及gunzip解壓指令（nohup+指令+&可以背景運作）
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故安裝指令apt-get install fastqc
3.2 使用FastQC進行品質檢查 fastqc指令：
fastqc -o . -t 5 -f fastq SRR3101251.fastq &
-o . 将結果輸出到目前目錄
-t 5 表示開5個線程運作
-f fastq SRR3101251.fastq 表示輸入的檔案
（要分别對四個fastq檔案執行四次）
4、使用Bowtie對Reads進行Mapping 4.1 Bowtie的安裝 Ubuntu軟體包内自帶bowtie
故安裝指令apt-get install bowtie
4.2 下載下傳人類參考基因組 文獻說序列比對到了人類參考基因組GRCh37/hg19上
bowtie官網上面有人類參考基因組hg19已經建好索引的檔案
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再執行解壓縮指令：unzip hg19.ebwt.zip
4.3 使用bowtie進行比對 bowtie指令：
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python setup.py install
5.2 使用Macs模組化，尋找Peaks富集區 MACS指令：
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RPM公式：(某位置的reads數目÷所有染色體上總reads數目)×1000000
6.2 使用wigToBigWig轉化格式 Chip-seq流程報告1、硬體平台2、系統平台3、軟體平台4、資料庫資源5、研究對象1、Aspera軟體下載下傳及安裝2、Chip-Seq資料下載下傳3、FastQC品質檢查4、使用Bowtie對Reads進行Mapping5、MACS尋找Peak富集區6、IGV可視化7、ROSE鑒定Enhancer1、Chip-Seq資料下載下傳2、FastQC品質檢查3、使用Bowtie對Reads進行Mapping4、MACS尋找Peak富集區5、IGV對peaks可視化6、ROSE分析結果1、結論2、讨論 6.3安裝IGV(Integrative Genomics Viewer)對結果可視化 從IGV官網下載下傳windows版本http://software.broadinstitute.org/software/igv/download根據提示安裝
直接點選打開igv.jar或者對bat檔案以管理者身份運作
首先，載入hg19基因組；接着載入兩個normalised後的bw檔案即可
7、ROSE鑒定Enhancer 7.1 ROSE程式安裝 ROSE程式可以到http://younglab.wi.mit.edu/super_enhancer_code.html下載下傳，并且有2.7G的示例資料
7.2 資料預處理 Chip-seq流程報告1、硬體平台2、系統平台3、軟體平台4、資料庫資源5、研究對象1、Aspera軟體下載下傳及安裝2、Chip-Seq資料下載下傳3、FastQC品質檢查4、使用Bowtie對Reads進行Mapping5、MACS尋找Peak富集區6、IGV可視化7、ROSE鑒定Enhancer1、Chip-Seq資料下載下傳2、FastQC品質檢查3、使用Bowtie對Reads進行Mapping4、MACS尋找Peak富集區5、IGV對peaks可視化6、ROSE分析結果1、結論2、讨論 7.3運作ROSE程式 Chip-seq流程報告1、硬體平台2、系統平台3、軟體平台4、資料庫資源5、研究對象1、Aspera軟體下載下傳及安裝2、Chip-Seq資料下載下傳3、FastQC品質檢查4、使用Bowtie對Reads進行Mapping5、MACS尋找Peak富集區6、IGV可視化7、ROSE鑒定Enhancer1、Chip-Seq資料下載下傳2、FastQC品質檢查3、使用Bowtie對Reads進行Mapping4、MACS尋找Peak富集區5、IGV對peaks可視化6、ROSE分析結果1、結論2、讨論 7.4 進行基因注釋 Chip-seq流程報告1、硬體平台2、系統平台3、軟體平台4、資料庫資源5、研究對象1、Aspera軟體下載下傳及安裝2、Chip-Seq資料下載下傳3、FastQC品質檢查4、使用Bowtie對Reads進行Mapping5、MACS尋找Peak富集區6、IGV可視化7、ROSE鑒定Enhancer1、Chip-Seq資料下載下傳2、FastQC品質檢查3、使用Bowtie對Reads進行Mapping4、MACS尋找Peak富集區5、IGV對peaks可視化6、ROSE分析結果1、結論2、讨論 7.5 編寫R程式，繪制Enhancer及鄰近基因 Chip-seq流程報告1、硬體平台2、系統平台3、軟體平台4、資料庫資源5、研究對象1、Aspera軟體下載下傳及安裝2、Chip-Seq資料下載下傳3、FastQC品質檢查4、使用Bowtie對Reads進行Mapping5、MACS尋找Peak富集區6、IGV可視化7、ROSE鑒定Enhancer1、Chip-Seq資料下載下傳2、FastQC品質檢查3、使用Bowtie對Reads進行Mapping4、MACS尋找Peak富集區5、IGV對peaks可視化6、ROSE分析結果1、結論2、讨論 圖表 6 TE7.r程式
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四、結果
1、Chip-Seq資料下載下傳 Chip-Seq資料下載下傳并解壓結果
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2、FastQC品質檢查 資料品質檢查
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3、使用Bowtie對Reads進行Mapping 3.1基因組檔案 Chip-seq流程報告1、硬體平台2、系統平台3、軟體平台4、資料庫資源5、研究對象1、Aspera軟體下載下傳及安裝2、Chip-Seq資料下載下傳3、FastQC品質檢查4、使用Bowtie對Reads進行Mapping5、MACS尋找Peak富集區6、IGV可視化7、ROSE鑒定Enhancer1、Chip-Seq資料下載下傳2、FastQC品質檢查3、使用Bowtie對Reads進行Mapping4、MACS尋找Peak富集區5、IGV對peaks可視化6、ROSE分析結果1、結論2、讨論 圖表 11人類參考基因組HG19索引
3.2 Mapping結果 Chip-seq流程報告1、硬體平台2、系統平台3、軟體平台4、資料庫資源5、研究對象1、Aspera軟體下載下傳及安裝2、Chip-Seq資料下載下傳3、FastQC品質檢查4、使用Bowtie對Reads進行Mapping5、MACS尋找Peak富集區6、IGV可視化7、ROSE鑒定Enhancer1、Chip-Seq資料下載下傳2、FastQC品質檢查3、使用Bowtie對Reads進行Mapping4、MACS尋找Peak富集區5、IGV對peaks可視化6、ROSE分析結果1、結論2、讨論 圖表 12 Mapping整體結果
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4、MACS尋找Peak富集區 4.1MACS結果檔案 Chip-seq流程報告1、硬體平台2、系統平台3、軟體平台4、資料庫資源5、研究對象1、Aspera軟體下載下傳及安裝2、Chip-Seq資料下載下傳3、FastQC品質檢查4、使用Bowtie對Reads進行Mapping5、MACS尋找Peak富集區6、IGV可視化7、ROSE鑒定Enhancer1、Chip-Seq資料下載下傳2、FastQC品質檢查3、使用Bowtie對Reads進行Mapping4、MACS尋找Peak富集區5、IGV對peaks可視化6、ROSE分析結果1、結論2、讨論 圖表 14 TE7實驗對照組結果
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4.2 MACS結果解讀 Peaks.xls從左至右依次是：峰所在的染色體名稱，峰的起始位置，峰的結束為止，峰的長度，峰的高度，貼上的reads标簽個數，pvalue(表示置信度)，峰的富集程度，FDR假陽性率(越小則峰越好)
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negative_peaks.xls當有對照組實驗存在時，MACS會進行兩次peak calling。第一次以實驗組（Treatment）為實驗組，對照組為對照組，第二次颠倒，以實驗組為對照組，對照組為實驗組。這個相當于颠倒過後計算出來的檔案
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Peaks.bed檔案相當于Peaks.xls的簡化版，從左至右依次是：峰所在的染色體名稱，峰的起始位置，峰的結束為止，峰的MACS名稱，pvalue(表示置信度)
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summits.bed是峰頂檔案，從左至右依次是：峰所在的染色體名稱，峰頂的位置，峰的MACS名稱，峰的高度
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MACS_wiggle檔案夾下面分為control檔案夾和treat檔案夾，裡面分别存了control組和treat組每隔50bp，貼上的reads數目。第一列為染色體上的位置；第二列為從第一列對應的位置開始，延伸50bp，總共貼上的标簽(reads)個數。
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model.r檔案可以使用R運作，繪制雙峰模型的圖檔PDF
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5、IGV對peaks可視化 5.1Normalised後，wig檔案與文獻資料比較 Chip-seq流程報告1、硬體平台2、系統平台3、軟體平台4、資料庫資源5、研究對象1、Aspera軟體下載下傳及安裝2、Chip-Seq資料下載下傳3、FastQC品質檢查4、使用Bowtie對Reads進行Mapping5、MACS尋找Peak富集區6、IGV可視化7、ROSE鑒定Enhancer1、Chip-Seq資料下載下傳2、FastQC品質檢查3、使用Bowtie對Reads進行Mapping4、MACS尋找Peak富集區5、IGV對peaks可視化6、ROSE分析結果1、結論2、讨論 圖表 24 peaks整體統計比較
5.2 IGV peaks整體可視化 Chip-seq流程報告1、硬體平台2、系統平台3、軟體平台4、資料庫資源5、研究對象1、Aspera軟體下載下傳及安裝2、Chip-Seq資料下載下傳3、FastQC品質檢查4、使用Bowtie對Reads進行Mapping5、MACS尋找Peak富集區6、IGV可視化7、ROSE鑒定Enhancer1、Chip-Seq資料下載下傳2、FastQC品質檢查3、使用Bowtie對Reads進行Mapping4、MACS尋找Peak富集區5、IGV對peaks可視化6、ROSE分析結果1、結論2、讨論 圖表 25 IGV可視化
6、ROSE分析結果 6.1 資料預處理結果 Samtools将sam檔案轉化為bam檔案，并且排序，再建立索引
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6.2 ROSE程式Enhancer分類結果 Chip-seq流程報告1、硬體平台2、系統平台3、軟體平台4、資料庫資源5、研究對象1、Aspera軟體下載下傳及安裝2、Chip-Seq資料下載下傳3、FastQC品質檢查4、使用Bowtie對Reads進行Mapping5、MACS尋找Peak富集區6、IGV可視化7、ROSE鑒定Enhancer1、Chip-Seq資料下載下傳2、FastQC品質檢查3、使用Bowtie對Reads進行Mapping4、MACS尋找Peak富集區5、IGV對peaks可視化6、ROSE分析結果1、結論2、讨論 圖表 27 TE7 Enhancer分類結果
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peaks_AllEnhancers.table.txt檔案從左到右分别是，Enhancer區域名稱ID，染色體位置，Enhancer起始位置，結束位置，由多少個Enhancer縫合連接配接而成，Enhancer大小，Treat組峰高度，Control組峰高度，Enhancer大小排名，是否為Super Enhancer
Chip-seq流程報告1、硬體平台2、系統平台3、軟體平台4、資料庫資源5、研究對象1、Aspera軟體下載下傳及安裝2、Chip-Seq資料下載下傳3、FastQC品質檢查4、使用Bowtie對Reads進行Mapping5、MACS尋找Peak富集區6、IGV可視化7、ROSE鑒定Enhancer1、Chip-Seq資料下載下傳2、FastQC品質檢查3、使用Bowtie對Reads進行Mapping4、MACS尋找Peak富集區5、IGV對peaks可視化6、ROSE分析結果1、結論2、讨論 圖表 29 peaks_AllEnhancers.table.txt檔案
peaks_Plot_points.png圖檔，縱坐标為peaks_AllEnhancers.table.txt中G,H列相減結果，及減掉對照組峰後的高度，橫坐标為全部Enhancer的排名，越可能是SuperEnhancer則越靠圖的右邊。
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6.3 基因注釋結果 AllEnhancers_ENHANCER_TO_GENE.txt第J列開始為離Enhancer最近的基因名稱
AllEnhancers_GENE_TO_ENHANCER.txt第1列為基因名，後面為鄰近峰的名稱
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五、讨論和結論
1、結論 1.1 FastQC品質檢查 FastQC 版本和機房小型機不同，為v0.10.1，是以檢測結果略有差別。圖表 8 品質檢查結果顯示，測序品質挺好，Per base sequence content、Per sequence GC content、Kmer Content出現警告更可能是由于測序方法本身存在的固有誤差。
1.2 bowtie整體覆寫度 由圖表 10 Mapping整體結果可以看出，四個fastq檔案Mapping整體覆寫率都在90%以上，從另一方面說明資料品質很好
1.3 ROSE辨識出的Super Enhancer 由圖表 29 TE7_peaks_Plot_points.png圖表 28 KYSE510_peaks_Plot_points.png可以看出，在TE7細胞系中，找出了439個Super Enhancer，在KYSE510細胞系中，找出了823個Super Enhancer。
2、讨論 由IGV可視化圖可以看出，峰的高度和位置基本和文獻相同。
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再用R程式根據ROSE程式結果，繪制和文獻相同的圖檔，與文獻的圖檔進行比較，可以看出來，基因的分布是相似的，就是具體位置和文獻不是很一樣。
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在MACS結果中，有些很窄的峰高度明顯比文獻要低，這可能是因為bowtie時候，設定的參數使得多條reads比對上僅輸出一次，使得峰高度減小。
在ROSE結果中，MIR205HG沒有标注出來，而文獻中有此基因，經過檢查，在相似位置ROSE程式有找到MIR205基因，這可能是基因注釋檔案和文獻不同導緻的。
參考文獻
[1] Targeting super-enhancer-associated oncogenes in oesophageal squamous cell carcinoma PMID: 27196599
