生信分析怎麼一步步篩選的？
分析思路是别人代替不了你思考的，也沒有什麼捷徑。别人提供給你的思路那也是别人自己會的而不是你會；一定要自己去實打實積累，消化，學習文獻最好能自己實操去畫“分析流程圖”（學習技巧），這樣思路掌握紮實些。
part 1：第一篇
類型：熱點基因集+免疫浸潤+WGCNA+調控網絡+單細胞+實驗驗證
一、DEGs的識别及分析
必備的分析内容，差異基因和功能富集。其中差異分析的分組也是正常的疾病vs對照（AS vs control）。需要注意下，挑選幾個資料集？有無發表過？樣本量多少？功能富集注意下富集是挑哪些基因展開分析的？
然後注意下選取熱點基因集的方法：取交集，畫韋恩圖；其次，熱點基因怎麼來的？
二、免疫浸潤分析及共表達網絡共建之前建議過不要專門把“免疫”作為熱點去設計課題，因為免疫所有疾病都能結合，最好是除免疫外，再加個熱點。這篇也是，“動脈粥樣硬化(AS)是一種慢性發炎性疾病。免疫代謝和氧化應激之間存在複雜的互相作用。為了确定AS中的氧化應激和免疫相關的生物标志物”
經典的免疫結果圖（必備分析）；增加WGCNA（注意下選取什麼子產品進行下一步分析？）：Modules with high correlation coefficients were considered as candidates related to differentially infiltrating immune cells and selected for subsequent analyses.通過子產品的相關分析和免疫特征分析發現綠松石子產品與巨噬細胞M0高度正相關，藍色子產品與T細胞高度正相關（圖5a-c）。
三、差異表達的免疫相關氧化應激基因的鑒定及功能富集分析
鑒定出27個差異表達的免疫相關氧化應激基因（DEIOSGs）。有同學問，怎麼又功能富集分析？在某些人的分析架構，GO/KEGG隻能出現在第一步的DEGs差異基因分析之後。
熟悉的GO/KEGG-PPI網絡，注意下篩選的top1的module分子，後續是否有拿來用？建構DEIOSGs的PPI網絡并進行可視化分析，共獲得六個Hub基因：NCF2、MMP9、ALOX5、NCF1、NCF4和CYBA。（圖7a-b）
四、鑒定Hub基因，并進行表達及功能分析
表達，ROC，外部資料集驗證發現，除CYBA外，所有其他基因的AUC區域均為>0.7。并且5個hub基因之間呈顯著正相關。（注意，可以學習下hub gene正常鑒定的分析名額）
五、關鍵基因與免疫細胞的相關性分析
六、關鍵miRNAs、TF和藥物-基因網絡的GSEA分析和預測
為什麼要分析miRNA，分析TF，還有drug？Twenty-one potential drugs for treating patients with AS were identified when the drug-gene interactions were explored using CTD. Additionally, drug-gene networks were constructed using the Cytoscape (Supplement 4).
（注意，為何要多這麼一步分析？跟熱點取交集？）将上調和下調的DEGs與鐵死亡、焦亡和壞死基因集進行交集，發現13個鐵死亡相關的DEGs上調，10個壞死相關的DEGs上調，8個焦亡相關的DEGs上調(Figure 12(a), Supplement Figures 5(a) and 5(b)).将上調鐵死亡相關的DGEs與藍色和綠松石子產品中的基因之間的交集，鑒定了4個上調的免疫相關鐵死亡基因：ALOX5、NCF2、AURKA和SLC2A6。（圖12a-b）（注意，這裡篩選的基因，與上述的5個hub gene，有無聯系？）
七、利用單細胞分析鑒定免疫相關鐵死亡基因并在體内外驗證其表達
ALOX5和NCF2在巨噬細胞M1、巨噬細胞M2和單核細胞中顯著高表達。體外實驗顯示ALOX5和NCF1、NCF2、NCF4在AS組中高表達。（圖13a-13c、圖14a）（注意，這裡選取驗證的基因是哪些基因？是hub gene還是鐵死亡交集基因？）
IHC結果顯示，AS組的ALOX5和NCF2的陽性區域均高于對照組。Western Blot結果進一步證明，ALOX5和NCF2在AS組中的表達量高于對照組。（圖14b-h）（注意，為何最後隻選這兩個基因進行實驗驗證？）
此外，本文還探讨了鐵死亡與浸潤性免疫細胞之間的關系，并證明了ALOX5和NCF2對動脈粥樣硬化具有良好的診斷價值。
跟着基因走，看看基因數量怎麼一步步變少，怎麼一步步篩選最後聚焦到2個基因的
#生信分析#
