要了解整個流程，個人覺得可以按資料的四個流程來拆分：高通量測序，準備工作，上遊分析，下遊分析
【什麼是高通量轉錄組測序】
所謂高通量測序技術是什麼？
顧名思義，就是通量很高（對比sanger測序）的測序，一次性可以獲得海量的資料，是以叫高通量測序。
轉錄組是什麼？
轉錄組，一般指的就是某一時空條件下細胞所産生的所有轉錄産物，說人話就是，你的樣品經過了某種處理，然後拿去提了總RNA，這個總RNA就是一個轉錄組。
了解高通量轉錄組測序的關鍵在哪？
首先是建庫，我們建的文庫用的是什麼，rna嗎？不是，那用的是什麼？
cDNA，即rna拿去逆轉錄的産物，為什麼要用DNA而不是RNA？
除了單鍊RNA不穩定外，還有一小部分原因是DNA的建庫流程已經确定了，隻要把RNA變成DNA後面流程完全一樣，可以偷個懶，不過為了節約時間可以在一二鍊合成的時候直接加好接頭，後面就連接配接頭都不用加了，縮短建庫的時間，一天可以輕松完成建庫
其次就是什麼是橋式pcr？
上面就是橋式pcr的流程，簡而言之就是序列接頭（adapter）一端被固定，然後另一端跟反應槽裡的互補序列配對，呈現橋狀，然後再進行pcr，故而稱橋式pcr。
經過n輪橋式pcr之後，一個序列可以擴增到一個歎為觀止的水準，故而通量就非常高了~
最後是測序信号是怎麼得到的？
熒光基團，在所有的堿基上我都接了熒光基團
想更直覺了解的這裡放個illumina的官方介紹
illumina測序原理簡介_哔哩哔哩 (゜-゜)つロ 幹杯~-bilibiliwww.bilibili.com/video/BV1ht411q7Wh?from=search&seid=17159547191666876555正在上傳…重新上傳取消
【準備工作】
首先，我們拿到的原始序列檔案就是fastq，那麼怎麼去了解fastq檔案呢？
ST-E00126:128:HJFLHCCXX:2:1101:7405:1133
TTGCAAAAAATTTCTCTCATTCTGTAGGTTGCCTGTTCACTCTGATGATAGTTTGTTTTGG
+
FFKKKFKKFKF<KK<F,AFKKKKK7FFK77<FKK,<F7K,,7AF<FF7FKK7AA,7<FA,,
上面這裡是一個fastq檔案的格式，每一行代表什麼呢？
第一行就是測序的坐标資訊，即告訴你這條reads的名字是什麼
第二列就是我們測到的序列
第三列就一個加号，沒卵用
第四列，品質資訊，對應着上面各個堿基，測得有多臭，具體多臭下面說怎麼直覺的看
需要了解的就這麼多，如果要仔細了解，看下面這個文章
孟浩巍：20160406 FASTA 與 FASTQ格式詳解227 贊同 · 39 評論文章正在上傳…重新上傳取消
怎麼對測序品質這些東西進行直覺化？
有個東西叫做fastqc的軟體，可以對fq檔案進行質檢，具體怎麼看呢？看這個貼子
孟浩巍：20160410 測序分析——使用 FastQC 做質控327 贊同 · 78 評論文章正在上傳…重新上傳取消
在明白了自己的測序資料有多臭之後，我們就要将資料中低品質的部分全部剔除掉，剔除的軟體有很多，類似Trimmomatic，fastp，cutadapter
一般給定的标準就是清除存在的所有接頭序列，過濾掉q小于20的堿基，去除N堿基大于5%的序列，去除A與T或者C與G含量相差10%的序列，去除切除堿基後過短的序列，這個标準一般通用，具體可以根據自己資料去篩選。
想詳細了解的看這個貼子
孟浩巍：20160420-序列比對前的準備工作92 贊同 · 42 評論文章正在上傳…重新上傳取消
準備工作完成之後，我們就得到了一份高品質的原始資料（clean data），進而正式進入分析工作
【上遊分析】
無論是以前的bowtie2+samtools+cufflinks+deseq2，還是現在轉錄組的當紅炸子雞流程hisat2+stringtie+ballgown，其本質的工作流程其實是一樣的，隻不過使用的算法不同而已。
第一步叫做回帖，這一步是幹嘛的呢？
首先，我們的fastq檔案存儲的資料是一個零散的狀态，那要怎麼樣把它恢複到打斷前的狀态？
這裡我們就需要一個模闆，按照模闆，我們把序列排序，大概就長這個樣子
這裡的ref就是模闆，即參考基因組，而我們的fastq檔案本質就是一條一條的小序列，在模闆的指引下，我們得到了他們原本在基因組上應該在位置，這一步就是回帖的含義。
也即是bowtie2跟hisat2所幹的事。
而關于回帖的細節，可以看這兩篇
孟浩巍：踏踏實實做技術：BWA，Bowtie，Bowtie2的比對算法推導109 贊同 · 13 評論文章正在上傳…重新上傳取消
生信小撰：【生信常識】二代測序的比對算法淺析72 贊同 · 16 評論文章正在上傳…重新上傳取消
回帖完之後，我們的回帖資訊會被輸入到一個文本檔案：SAM檔案（二進制位bam檔案）
sam檔案有個頭檔案，即你看到這張圖前面那樣，存儲着染色體的資訊，還有你之前比對的指令，但這些不是我們需要了解的重點，我們需要來看看下面存儲着什麼？
第一列是什麼？就剛剛fastq檔案的第一列，就是這條reads的名字
第二列是什麼？flag？太複雜了，不記了
第三列？染色體
第四列？染色體的起始位置
第五列？回帖的可信度，即回帖品質
第六列？第七列？看不懂，不管了
後面還有回帖上的序列
總的來看，所謂的sam/bam檔案就是記錄回帖的序列是什麼，回帖上多少，回帖的品質行不行，回帖到什麼位置。
而後就是用cufflinks或者stringtie結合注釋檔案gff/gtf，将轉錄本建構出來。
那麼gff/gtf是什麼？簡而言之，gff就是記錄了這個物種在哪個位置有功能，是gene還是調控因子。
孟浩巍：生物資訊學100個基礎問題 —— 第24題 GFF，GTF到底是什麼？64 贊同 · 3 評論文章正在上傳…重新上傳取消
而cufflinks要做的事情就是将bam檔案的比對資訊跟gff的資訊結合起來，拼出一條轉錄本
bowtie2做的事情是
而cufflinks做的事情則是這個
【下遊分析】
當使用cufflinks建構得到raw count之後，我們就想比較不同處理間的差異在哪，那麼這個時候我們可以直接比較嗎？
當看到我這麼問的時候，肯定就是說不可以。
那麼，為什麼不可以？
拿孟孟之前舉的例子
問題1: 比如我有gene3，有1000條測序reads，gene4有2000條測序reads，那麼我能否說gene4就一定比gene3的表達量高？
問題2: 比如我有gene1，有1000條測序reads，我的另一個處理條件下gene2有2000條測序reads，我能否就說geneA在處理條件下表達量降低了？
圖1 ( Manuel Garber et al., Nature Methods, 2011 )
很明顯，第一個問題，如果兩個基因的長度不一緻，那是無法直接比較的；而第二個問題，我們就需要考慮如何矯正了，而這個矯正值就是所謂的RPKM/FPKM/TPM，關于這些是什麼
請看這個貼子
孟浩巍：生物資訊學100個基礎問題 —— 第35題 RNA-Seq 資料的定量之RPKM和FPKM93 贊同 · 13 評論文章正在上傳…重新上傳取消
孟浩巍：生物資訊學100個基礎問題 —— 第36題 RNA-Seq 資料的定量基本假設以及TPM35 贊同 · 17 評論文章正在上傳…重新上傳取消
當我們将所有的東西放同一個标準下，就可以進行比較了，而比較的時候，即肯定存在兩個組才能進行比較，也就是我們的control跟treatment
以control為标準，比較treatment，我們就知道了差異究竟在哪些基因，即所謂的差異表達
現實計算肯定要複雜的多，但作為粗略了解，這樣會比較容易了解
而當我們得到一堆差異基因之後，就通常要做所謂的富集分析，常見的有GO，KEGG。
以常見基于ORA算法的富集舉例
本質其實就是一個超幾何分布，常見的就是Fisher extract test
算出一個p值即可，然後自選标準，大于多少認為是顯著的，認為某某通路上存在差異表達。
想更具體了解，可以看看這個視訊
【GCModeller教程】基因組功能富集計算原理_哔哩哔哩 (゜-゜)つロ 幹杯~-bilibiliwww.bilibili.com/video/BV1R4411d7xe正在上傳…重新上傳取消
本期内容就到這裡，還望各路大神輕噴，同時歡迎各位大神指點一下哪裡可以寫得很通俗而不失謹慎，友善新入門的小夥伴更好的了解整個分析流程~