基于高通量表型的QTL定位揭示了甘藍型油菜耐鹽脅迫的遺傳結構

#公衆号：作物表型記錄本

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摘要：

對3種不同鹽脅迫條件下的自然群體和9種不同脅迫條件下的品種間代換系群體的2111個基于圖像的性狀（i ‐ traits）進行了定量分析，以監測和評價油菜的耐鹽性。最終鑒定出928個與甘藍型油菜耐鹽性相關的優質I-性狀。此外，我們通過GWAS繪制了自然群體中與鹽脅迫相關的基因座，并分别進行了與ISL群體相關的連鎖分析。結果表明，篩選出234個與鹽脅迫應答相關的候選基因，其中2個新的候選基因BnCKX5和BnERF3被實驗證明與調控甜菜的鹽脅迫耐受性有關。

• 耐鹽系數(STC)=不同時間點鹽脅迫條件(T)/正常條件(CK)
• 鹽濃度(%)=W1(NaCl含量)/W2(土壤幹重)
• （R_max）：重複間的相關系數

• (PH)plant height ,(AFB)aboveground fresh weight , (ADB)aboveground dry weight , (LA)leaf

  area , (Stem_DW)stem dry weight , (Stem_FW)stem fresh weight ,(SPAD)chlorophyll content ,

1. 介紹

• 從505份自然群體和91份(ISL)中提取了54個側向(CS)衍生性狀、17個頂向(DS)衍生RGB衍生性狀和2040個高光譜衍生性狀（I-traits）。
• 通過基于I-性狀的GWAS和連鎖分析，鑒定并比較了與耐鹽性相關的QTLs。預測了234個與鹽脅迫反應相關的候選基因，其中BNCKX5和BNERF3分别位于CHRA02和CHRA06上，進一步對候選基因的耐鹽性功能驗證。
• 通過505份自然群體和91份ISL群體的原始圖像、基因型和表型資料的GWAS和連鎖分析，對甘藍型油菜的鹽脅迫反應進行了評價。

2. 實驗材料與方法

2.1 材料：

• 505份自然群體和91份ISL群體

2.2 逆境處理與高通量表型分析

• 505份自然群體：

  

• 505份ISL群體：

  

  鹽濃度（%）= W1（NACL含量）/W2（土壤幹重）

2.3 高通量表型圖像分析與性狀提取*（Visual Studio 2015（Microsoft）和OpenCV 3.4）*

• (CS-RGB)圖像的處理：

（1）用一個預定義的矩形塊從原始側視(CS)圖像中去除傳送帶和其他雜質，得到裁剪後的圖像；

（2）将RGB圖像轉換為HSI彩色模式進行分割。 三個門檻值分别應用于三個平面。 色相平面的0-141，飽和度平面的38-255，強度平面的41-255的數值用步驟1代替。 然後利用分割後的二值圖像計算形态學相關特征；

（3）利用第二步二值圖像處理得到的圖像凸殼，計算出

其他形态學相關特征。

（4）采用二值圖像作為圖像的掩模對步驟1得到的灰階通道的RGB圖像和相應的灰階圖像進行處理，然後從這些圖像中計算出顔色相關特征和直方圖紋理相關特征；

（5）最終生成20個CS圖像，并獲得每個樣本的I-性狀。

• （DS-RGB）圖像的處理

（1）使用預先定義的矩形塊去除原始DS圖像中的傳送帶等雜質，得到裁剪後的圖像;

（2）采用過綠（E × G）分割方法從原始DS-衍生的RGB圖像中獲得分割的二值圖像，然後計算形态學相關特征;

（3）将二值圖像作為原始DS圖像的模闆，計算處理後的RGB圖像、灰階通道的灰階圖像、綠色通道的灰階圖像等的直方圖紋理特征和顔色相關特征。

• (GGP-RGB)處理

（1）從HSI成像系統獲得一個樣本的二進制資料流，并且最終重組這些二進制資料流以獲得250個GGP圖像（支援資訊：表S3）;

（2）從這250個GGP圖像中選擇兩個進行分割以獲得新的灰階圖像。然後對灰階圖像進行分割，得到新的二值圖像，并對二值圖像進行處理;

（3）使用步驟2中的二值圖像對250張GGP圖像進行掩模，随後對這些圖像進行處理以計算光譜特性，包括全反射率相關特性、平均反射率相關特性和對數相關特性。

2.4 人工測量形狀

• 

• 其中包括了葉片葉綠素，脯氨酸，丙二醛，相對電導率

2.5 鹽脅迫反應相關性狀的高重複性、高遺傳力和顯著處理效應的測定

為了選擇具有高重複性、高遺傳力和顯着處理效果并與鹽脅迫反應相關的性狀，

開發出了算法：離群點檢測、計算重複間的相關系數（R_max）強弱、動态遺傳力分析、計算方差分量（包括遺傳效應、處理效應、遺傳效應與處理效應的互作效應）、最終篩選出了928個優質i_traits）

2.6 I-性狀與傳統農業性狀的相關網絡

為了将高通量表型測定的性狀與傳統的農藝性狀和生理性狀聯系起來，對這些性狀進行了破壞性測定，并進行了相關分析建構了一個包含不同生育期和脅迫條件的大相關網絡(Pearson相關系數®≥0.3,P<0.001)。 利用GEPHI對相關網絡進行了可視化.

2.7 GWAS與連鎖分析

• 對505份自然群體，GWAS分析鑒定到657,136個顯著的SNPs，人工測量性狀鑒定到5,531個與鹽脅迫響應相關的顯著SNPs，GGP圖像名額鑒定到283,227個與鹽脅迫響應相關的SNPs；
• 對91個ISL群體進行連鎖分析，GBS測序。

2.8 候選基因的功能研究

為了驗證候選基因在鹽脅迫下的功能，從X182(97097)中克隆BNAA02G05340D(BNCKX5)和BNAA06G02670D(BNERF3)的編碼DNA序列，然後用KpNI和XBAI限制性内切酶消化PCR片段，用連接配接酶連接配接到pCambia-1300S載體上，用Westar（WT）作為轉基因受體材料。

3 結果

3.1 高通量表型分析油菜脅迫條件

505份自然群體

• 在T1-T5（T1-T3時期收集RGB和GGP圖像，T4-T5時期收集RGB圖像）的5個時間點，我們總共收集了454500張CS衍生的RGB圖像、22725張DS衍生的RGB圖像和13635張GGP圖像。

91個ISL群體

• 在T1-T5的5個時間點，共收集了245700張CS衍生的RGB圖像和12285張DS衍生的RGB圖像。

人工測量形狀

提取I-性狀

從505份自然群體和91份ISL群體提取54幅RGB衍生I-性狀的CS圖像（支援資訊：表S4)和17幅RGB衍生I-性狀的DS圖像（圖 1c；支援資訊表S5)；2040個GGP I-性狀,共2111張I-traits

• 為了評價表型平台的性能，對20份随機種質進行生長和測量，以評價高通量表型平台的測量和性能，并通過破壞性抽樣和高通量表型平台的無損測量，包括CS RGB衍生測量、DS RGB衍生測量、GGP測量和傳統農業和生理性狀的人工測量，建構了一個可靠和穩健的模型，以評估和預測三種鹽脅迫條件下五個時間點的植物傳統農業性狀。
• 總共評估并進一步分析了8792個原始I-性狀，包括432個CS RGB衍生性狀、136個DS RGB衍生性狀、8160個高光譜衍生(GGP)I-性狀和64個傳統衍生（破壞性獲得）性狀（圖1c)(Guo et al.，2018)。

  

3.2在鹽脅迫下确定與鹽脅迫反應相關的高重複性、高遺傳力和顯著處理效果的可靠I-性狀

• 為了量化資料，基于門檻值的過濾程式（中位數±3SDS)建立了一系列過濾條件，并評估了三個生物複制之間的重複性。 重複性的過濾标準是中值相關系數大于0.5(R_max≥0.5)，選出CK、LY、HY處理下的CS、RGB、GGP(包括所涉及的GGP_marker)衍生性狀。 這些I-性狀在所有3個重複中顯示出高度的重複性（除去異常值後）（圖2a)。 通過描述性統計、動态熱圖和鹽脅迫響應的聚類圖趨勢，表明了在鹽脅迫下的動态變化和變異（圖1a-d；

  

• 計算和分析了505份材料和91份ISL在鹽脅迫下的廣義遺傳力(H2B)随時間的動态變化。 約64%的I-性狀H2B值大于0.5

  

• 将高遺傳力中位數(H2B≥0.5)和低鹽處理效應顯著相結合，獲得了1141個（54.05%）性狀;同時，我們獲得了1287個（60.97%）具有高遺傳力和高鹽處理效應的性狀。從三個重複間的穩定性來看，我們綜合了動态R_max中值和低處理效應，最終篩選出1801個性狀（85.32%）。 對于動态中值R_MAX 和高處理效應，共選擇了1976個性狀。

  

• 最後，通過嚴格的篩選标準，我們獲得了928個與鹽脅迫反應相關的性狀。

  

3.3 I-性狀作為鹽脅迫生物标記預測傳統性狀

• 為了預測傳統的農藝性狀，包括株高(PH)、地上鮮重(AFB)、地上幹

  重(ADB)、葉面積(LA)、莖幹重(STEM_DW)、莖幹鮮重(STEM_FW)和葉綠素含量(SPAD),開發了一系列涉及模型建構的非破壞性方法；從預測結果來看，經逐漸回歸分析和五重交叉驗證，大部分預測名額的調整決定系數(R2)均大于0.8：

利用預測模型，我們預測了随着時間的推移ADB、AFB和pH值,這些結果表明，我們建立的基于I-性狀的預測模型可用于鹽脅迫下甘藍型油菜農藝性狀的預測。

3.4 甘藍型油菜遺傳基礎解析

• 505份自然群體，我們通過與FAST-LMM和Gemma的線性混合模型進行了246個STCs的GWAS，其中包括324個CS RGB衍生性狀、102個DS RGB衍生性狀、756個高光譜衍生(GGP)性狀和4個人工測量性狀
• 對于91個ISL群體，利用ICI-mapping建構了鹽脅迫相關QTLs，通過連鎖分析，在不同時間點和不同鹽脅迫條件下涉及2132個RGB衍生性狀的耐性系數；
• 共鑒定了657,136個重要的SNP。其中确定了5531個與鹽脅迫反應相關的人工測量性狀的顯著SNP；還發現了3227個與GGP性狀顯著相關的SNPs。在人工測量的5531個顯著的SNPs中共有1197個顯著的SNPs與I-性狀相關的顯著SNPs共定位。 評估了鹽脅迫反應相關的顯著SNP的影響，其與随機SNP的影響顯著不同（圖3b）。具有共定位SNP頻率的性狀數量顯示了染色體上不同的熱點區域和分布區域（圖3c）。為了避免可能的假陽性顯著SNP，将與鹽脅迫反應相關的可靠SNP定義為具有10個以上共定位SNP（以頻率計）的SNP，這些SNP在染色體上呈現不同的數量（圖3d;支援資訊：表S12）。量化了在人工測量性狀和i ‐性狀之間共享共定位SNP的性狀。幾乎一半的人工測量性狀顯示了高頻SNP與50多個i-性狀的共定位，如脯氨酸濃度、ADB、相對電導率（REC）和産量（圖3e;支援資訊：表S12）

  

• 我們最終聚焦于234個與鹽脅迫反應相關的候選基因中，在CS RGB衍生性狀、DS RGB衍生性狀、高光譜衍生(GGP)性狀和人工測量性狀之間檢測到的2814個高頻和共定位SNPs。了（包括CS 、DS RGB性狀，GGP性狀和人工測量性狀在内的）2814個高頻和共定位SNP；SnRK2、RD20、SOS3、ABI5和WRKY33等許多先前報道的與鹽脅迫反應相關的基因在QTL定位中被發現，它們在野生型WT植物和鹽脅迫植物之間差異表達。

  

• 對91個ISL的連鎖分析，我們确定了204個分布在不同染色體上的顯著和高頻共定位QTL。

3.5 BNCKX5過表達增加對鹽脅迫的敏感性

• 通過GWAS在CHRA02上檢測到許多不同類型性狀的重要共定位SNPs我們檢測到57個高頻共定位的SNP,包括4個位于CHRA02上的SNP簇（簇I為2 062 941至2 518 619 bp；簇II為2 753745至3 206 647 bp；簇Ⅲ為11 141 835至11 142 240 bp；簇Ⅳ為23011 682從2 062 941到24 168 754 bp；在CHRA02上檢測到許多不

  同類型性狀的重要共定位SNPs:ADB_HDCK和SPAD_LDCK（人工測量性狀）； GPA_SV_CS5_HDCK和HA_SV_CS5_HDCK（RGB性狀）； 以及DA234_GGP2_HDCK、M4_HDCK_GGP3和M20_HDCK_GGP3(GGP特性）

• 在CHRA02簇I中，基于兩兩連鎖不平衡(LD)相關關系(R2>0.5), 在引物SNPBNVAA0202316797上下遊200kb内約有50個基因與ADB相關（圖 4a,b）。BNAA02G05340在鹽脅迫和ABA處理下得到高度誘導（圖 4c），并含有導緻氨基酸變化的SNP變異（圖 4d；BNAA02G05340命名為BNCKX5;其單倍型分為單倍型A、B、C（圖 4e–i），單倍型分析： 單倍型C的ADB在控制、低和高鹽脅迫顯著高于單倍型A和單倍型B下（圖 4e–g）。單倍型A在(ADB_LDCK)條件下的比值範圍與單倍型B和單倍型C之間差異顯著，但與單倍型B和單倍型C之間差異不顯著（圖 4h）。 此外，在ABD方面，高鹽脅迫下與對照條件下的單倍型B比值(ADB_HDCK)的範圍小于單倍型A比值（圖 4i）。 總之，這些結果表明，大約30個單倍型C型材料可能是抗鹽脅迫種質資源，是育種家的寶貴資源

• 從X182(97097)中克隆BNAA02G05340D(BNCKX5)和BNAA06G02670D(BNERF3)的編碼DNA序列，然後用KpNI和XBAI限制性内切酶消化PCR片段，用連接配接酶連接配接到pCambia-1300S載體上（支援資訊：表S16)。 克隆引物和測序引物來自青島生物技術武漢有限公司。 用Westar作為轉基因受體材料。将 BnCKX5轉基因至WT植物中，對其基因表達量進行分析

  

  CS的最小邊界盒高度(H_sv)（圖4s)、CS的綠色投影面積(GPA_sv)（圖4t)和CS的總投影面積(TPA_sv)；

3.6 BNERF3過表達提高抗鹽脅迫能力

• 我們通過不同類型的GWASS獲得了36個高頻共定位SNPs，在CHRA06上分為3個簇（簇I為1 695 085至2 163 217 bp；簇II為3 062 521至6618 806 bp；簇Ⅲ為18 159 306至21 636 994 bp）。通過我們的GWAS研究了一系列不同類型的性狀，如ADB_HDCK和REC_LDCK（人工測量性狀） ,HWR_TV_DS2_HDCK,FN_SV_LDCK_CS5（ RGB 性狀）,DT204_GGP3_LDCK和M35_LDCK_GGP2（高光譜來源性狀）,在CHRA06上發現了許多重要的共定位SNPs（圖）3g； 另外，U_tex_sv_cs4_ly标記A06_m2(LOD=26.57)和MU3_tex_tv_hylj标記A06_m2(LOD=10.97)之間的QTLs峰共定位于CHRA06（圖S10B)上。 在CHRA06簇I中，基于兩兩LD相關(R2>0.5)，在與ADB相關的前導SNPs BNVAA0601558949和BNVAA0601662590上下遊200 kb内約有40個候選基因（圖5a，b)。 BNAA06G02670D在鹽脅迫和ABA處理下被高度誘導（圖5C)，它含有導緻氨基酸變化的SNPs（圖5D；支援資訊：表S14)。 BNAA06G02670D命名為BNERF3，編碼ERF/AP2轉錄因子； 然而，該蛋白是否在植物耐鹽脅迫中起作用尚不清楚（Z.Zhang&Huang,2010）。 ERF家族基因在拟南芥、水稻、甘藍型油菜、番茄等植物中的過度表達已被證明可以提高對許多非生物脅迫的耐受性（Aharoni et al.，2004；Song et al.，2005)。

• 單倍型分析：單倍型B和單倍型C的505份材料的ADB值顯著高于單倍型A和單倍型D，且單倍型D的ADB值在對照、低鹽脅迫和高鹽脅迫下的4個單倍體類型中最低（圖5E-G)。 單倍型CADB(ADB_LDCK和ADB_HDCK)比值範圍大于其他單倍型（圖5H，I)。 無論實際ADB值和處理條件與對照條件的比值如何，單倍型B和單倍型C的範圍都低于其他兩種。 結果表明，單倍型C和單倍型D可能是敏感品種，包括25個品種；單倍型B可能是耐鹽品種，包括10個品種； 這些材料對育種家來說可能是豐富的種質資源（支援資訊：表S14)。

  

4 讨論

• 首次使用了一個高通量的表型平台，包括RGB衍生的和特别是GGP衍生的标記，以GWAS和連鎖分析為基礎來揭示鹽脅迫反應。
• HeatMap和聚類趨勢圖分析表明，與RGB衍生性狀相比，大多數高光譜衍生性狀強烈地反映了甘藍型油菜的鹽脅迫反應（支援資訊：圖S1)。
• 通過GGP成像，我們發現LGT1～LGT20和LGT150～LGT250等一系列不同波長範圍與ADB相關。 CS RGB衍生的SE_tex_sv、S_tex_sv和GPA_sv與pH值呈極顯著相關。
• 氯熒光成像可用于檢測對鹽脅迫響應的早期和晚期變化（Awlia等， 2016； 葛等人、2016）。
• 葉綠素含量被認為是脅迫的關鍵因素，并與DDT122和LGA120～LGA130等GGP型性狀密切相關。
• 産量性狀是重要的，我們發現CS RGB衍生的U_tex_sv、E_tex_sv、Tpa_sv和FDnic_sv以及DS RGB衍生的M_tex_tv、U_tex_tv、E_tex_tv和GPa_tv與産量名額密切相關。 這些不同類型的性狀可以作為反映鹽脅迫反應的名額。
• 建構了一個穩健的預測模型（支援資訊：圖S3-S5)，該模型可用于通過高通量表型平台預測與鹽脅迫 反應相關的傳統測量、動态測量和破壞性測量性狀，以促進耐鹽油菜的育種。
• 通過單倍型分析、序列變異分析、RNA測序(RNA-SEQ)、遺傳轉化和鹽脅迫下的功能驗證，
• 基于高通量表型的GWASS能有效地識别與鹽脅迫反應相關的基因或QTL，具有更多的主效和微觀效應，填補了關于甘藍型油菜鹽脅迫反應的研究空白。

5 結論

• 本研究揭示了一種新的和可靠的方法來解決與甘藍型油菜鹽脅迫反應相關的複雜農藝性狀。
• 一些基因或QTL可能是假陽性。 本研究僅鑒定出兩個基因，不足以揭示甘藍型油菜耐鹽脅迫的機理。需要驗證更多與鹽脅迫反應相關的候選基因。 是以，将多視角資料與高通量表型平台、GWASS和連鎖分析相結合，為研究甘藍型油菜的遺傳和分子機制提供新的途徑。

gzh：作物表型記錄本

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