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澳洲甘薯共生病毒(SPCV)分離株的特征分析

作者:霁夜談
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澳洲甘薯共生病毒(SPCV)分離株的特征分析

甘薯共體病毒(SPCV)是Caulimoviridae科Cavemovirus屬的成員,僅報道了一個全長基因組序列。

SPCV于2007年在澳洲首次使用國際馬鈴薯中心(CIP)開發的硝酸纖維素膜ELISA試劑盒在兩種甘薯種質中檢測到。

受感染的植物還顯示含有~50nm的等距病毒粒子,這是洞穴病毒,花椰菜病毒,Petuvirus和大豆病毒屬的典型成員。

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我們現在已經使用下一代測序和PCR / Sanger測序的組合對兩種SPCV分離株(指定為SPCV-Aus1和-Aus2)的完整基因組進行了測序和表征,兩種分離株的序列編碼三種主要的ORF,具有洞穴病毒典型的基因組組織。

然而,與SPCV-Aus2(7275 bp)相比,分離株SPCV-Aus1具有7712 bp的基因組長度相當短,并且是葡萄牙分離株(7723 bp;基因銀行入庫号NC_015328);此外,SPCV-Aus1的ORF 2比SPCV-Aus1和SPCV-Mad1的ORF 1長度短得多。

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系統發育和PASC分析表明,SPCV-Aus1與北美和中美洲的SPCV分離株密切相關,而SPCV-Aus2與葡萄牙和非洲的分離株聚集在一起。

甘薯是一種重要的塊根作物,在全球糧食作物産量中排名第七,年産量約為90萬噸,近年來,澳洲的甘薯産量大幅增加。

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從1990年的約6,000噸增加到2019年的78,000噸以上,對甘薯的需求增加和農藝實踐的改進促進了産量的增長,包括在1980年代引進新品種,生産系統的機械化,以及在2000年代初引入病原體檢測計劃,為甘薯種植者提供了随時獲得清潔種植材料的途徑。

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病毒感染是全球甘薯生産的主要制約因素之一,由于甘薯繁殖的營養性質,病原體積累發生在連續的繁殖周期中,在全球範圍内,人們一直在努力鑒定和表征感染甘薯的病毒,以及可能的植物衛生過程,以支援種質資源的安全交換。

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經病原體測試的清潔種植材料的可用性,将限制病毒傳播到新地區并提高産量。

全球甘薯報告了 2020 多種不同的病毒;然而,其中隻有五種,即甘薯羽毛斑駁病毒 (SPFMV)、甘薯病毒 2 (SPV2011)、甘薯氯斑病病毒 (SPCFV)、甘薯卷葉病毒 (SPLCV) 和甘薯共體病毒 (SPCV)。

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甘薯共體病毒(SPCV)(洞穴病毒屬,Caulimoviridae科),以前稱為甘薯花椰菜樣病毒(SPCaLV),于1987年(首次發現,此前觀察到來自波多黎各的甘薯直徑約50納米的等距顆粒,這些顆粒可移植到訓示宿主)。

此後,在幾個南太平洋國家(巴巴新幾內亞、東加和所羅門群島)、紐西蘭、加勒比群島、中美洲、中國、埃及、肯亞、葡萄牙和烏幹達的甘薯中發現了SPCV。

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然而,僅報道了一個源自葡萄牙的SPCV完整基因組序列(GenBank加入NC_015328),以及698912個SPCV部分複制酶序列(GenBank加入HQ698920 – HQ2011)和一個部分外殼蛋白序列。

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SPCV 是繼模式種木薯靜脈花葉病毒 (CsVMV) 之後表征的洞穴病毒屬的第二個成員,最近從仙人掌和菊苣中描述了另外兩種假定的洞穴病毒物種,分别暫定名為“附葉病毒 4”(EpV-4)和“菊苣花葉洞穴病毒”(ChiMV)。

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SPCV通常在甘薯中以無症狀感染的形式發生,迄今為止尚未發現昆蟲媒介。

然而,SPCV移植到訓示植物setosa誘導小的氯斑和斑點導緻壞死,SPCV 具有約 7.7 kb 的 dsDNA 基因組,具有四個開放閱讀框 (ORF) 和一個大的基因間區域,其中位于基因組前 RNA 啟動子、RNA 聚腺苷酸化信号和負義鍊引物結合位點。

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ORF 1編碼一種多功能蛋白,該蛋白被切割成兩個功能亞基,包括外殼蛋白(CP)和運動蛋白(MP),ORF 2編碼第二種多蛋白,該多蛋白被切割成天冬氨酸蛋白酶(AP),核糖核酸酶H(RNase H)和逆轉錄酶(RT)。

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這是所有Caulimoviridae成員的典型特征,而ORF 3編碼推定的包涵體蛋白(IBP);此外,還預測了小的第四ORF(ORFa),但沒有已知的功能。

有趣的是,SPCV,ChiMV和EpV-4的基因組組織與CsVMV略有不同,CsVMV在CP / MP編碼ORF和AP / RT / RNaseH編碼ORF之間有一個未知功能的小ORF。

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2007年,農業和漁業部(DAF)、加頓研究設施(GRF)通過對甘薯種質的正常病原體檢測,首次在澳洲從兩個甘薯品種中鑒定出SPCV,即GRF0085/Alleys-Red(從凱恩斯新鮮食品市場收集)和GRF0069/Beni-Aka(從日本進口,位于DAF雷德蘭茲研究設施的田間收集中)。

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在溫室實驗中将兩種甘薯種質嫁接到 setosa上,誘導SPCV感染的典型葉片症狀,包括環脈間綠斑和壞死斑點。1a-b),随後使用秘魯國際馬鈴薯中心(CIP)開發的硝酸纖維素膜ELISA(NCM-ELISA)試劑盒檢測出來自 setosa的葉組織對SPCV呈陽性。

在這裡,我們描述了表征兩種SPCV分離株的進一步工作,包括确定顆粒形态和細胞病理學作用的顯微鏡以及兩種分離株的完整基因組的分子分析。

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澳洲甘薯共體病毒(SPCV)分離株的特征a, 用感染分離物Beni-Aka的甘薯接穗嫁接的Ipomea setosa葉片中的SPCV感染症狀,用感染分離小巷-紅的甘薯接穗嫁接的 setosa 葉片中 SPCV 感染的症狀硝酸纖維素膜 ELISA 。

顯示從健康的、小巷紅 (AR) 或貝尼-阿卡 (BA) 感染的setosa 植物的重複葉片樣品中檢測到 SPCV——“老”和“幼”分别表示來自植物下部或上部的葉子。

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感染了分離物Beni-Aka的I. setosa葉組織的超薄組織切片的透射電子顯微照片,顯示感染細胞的細胞質中的病毒粒子(Bar = 200 nm) 用 2% 磷鎢酸 (pH 7) 負染色的 SPCV 分離物 Beni-Aka 感染的 I. setosa 純化的病毒樣顆粒的透射電子顯微照片。

使用 SPCV-Aus1000 和 SPCV-Aus7 ORF 1 的部分,複制酶序列在 MEGA2 中生成的最大似然系統發育樹(2 個自舉重複)(木薯靜脈花葉病毒(CsVMV),被用作外組。

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來自嫁接的I. setosa植物的葉組織用于電子顯微鏡研究,以鑒定受感染植物細胞中的病毒顆粒,為了檢測病毒粒子的存在,從健康和接枝接種的I. setosa葉組織樣品中切割超薄切片(約50-60nm)。

用乙酸鈾酰/檸檬酸鉛染色,并通過透射電子顯微鏡(TEM)在JEOL 1200EX透射電子顯微鏡下檢查80 kV,在I. setosa植物的切片中觀察到大量直徑~50nm的等距顆粒,這些顆粒嫁接了來自Alleys-Red和Beni-Aka的接穗)。

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随後基本上如Hull等人所述,從甘薯和I. setosa的葉子中純化病毒粒子,并在用2%磷鎢酸(pH 7)進行陰性染色後通過電子顯微鏡檢查;當用TEM檢查病毒粒子制劑時,在甘薯和I. setosa制劑的提取物中觀察到許多規則的二十面體顆粒,平均直徑~50nm。

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然後使用兩個受感染甘薯品種的葉片組織進行全核酸提取(TNA)、滾圈擴增(RCA)和二代測序(NGS);簡而言之,如Kleinow等人所述,從2009mg受感染的甘薯葉組織中分離出TNA,随後使用 2.5 μM 的核酸外切酶抗性随機六聚體(澳洲賽默飛世爾科技)進行 RCA,如 Sukal 等人所述。

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未消化的RCA産物使用Illustra™ GFX™ PCR DNA和凝膠帶純化試劑盒(GE Healthcare)純化,并發送到Macrogen使用Nextera™ XT樣品制備試劑盒(Illumina)進行文庫制備,并使用Illumina MiSeq平台進行測序。

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Alleys-Red和Beni-Aka樣品分别獲得了2,585,444和2,279,642個配對端讀數;使用FastQC v0.10.1評估MiSeq讀取的品質,修剪殘餘擴充卡序列。

以及使用Geneious v30.40.11 中的Bbbduk插件删除了低品質(Q < 0)和短讀數品質校正的讀取是使用嵌入式Genious彙編器從頭組裝的,随後,BLASTn 用于根據本地 RefSeq 病毒資料庫查詢大小 bp 的從頭組裝重疊群。

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這項工作報告了第一個從澳洲表征的全長SPCV分離株,補充了目前可用的SPCV的單一已發表的全長基因組序列,對這些新的完整序列的分析證明了SPCV-Mad1的基因組組織,其與CsVMV(洞穴病毒屬的類型成員)略有不同。

在現有的三種完全測序的SPCV分離株中沒有發現小的ORF2,同樣,最近報道的 ChiMV 和 EpV-4 也與三個完全表征的 SPCV 基因組序列具有相同的預測基因組組織。

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使用SPCV-Aus864和SPCV-Aus1的部分複制酶序列以及GenBank和CsVMV提供的其他SPCV序列(加入NC001648)進行系統發育分析,MEGA7用于将 ClustalW 的序列與預設設定對齊,并使用最大似然 (ML) 方法生成的系統發育樹,基于 Kimura-2 參數模型遵循最近鄰交換 ML 啟發式方法。

具有1000次自舉複制用于生成樹,系統發育分析表明,SPCV-Aus1與北美和中美洲的SPCV分離株一起,與墨西哥的Mex183和古巴的Cub44的分離株關系最密切。

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相比之下,SPCV-Aus2與SPCV-Mad1和來自非洲的1個分離株聚集在一起,來自瓜地馬拉(Gua154和Gua128)和巴拿馬(Pan1)的分離株形成了一個獨特的亞群,似乎是迄今為止測序的其他SPCV分離株組成的兩個亞群的祖先這些結果證明了澳洲甘薯中存在SPCV分離株,并将現在可用的全長序列數量從1個增加到2019個。

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SPCV-Aus1的ORF 1定位從nt 54到3,839,編碼1,261 aa的假定蛋白質,Mr為149.8 kDa,并包含預測的CP和MP結構域,ORF 2 定位于 nt 3832 至 5757 編碼推定蛋白質 641 aa,Mr為 75.6 kDa,包含 AP、RT 和 RNase H 結構域。

而 ORF 3 位于 nt 5687 至 6883 并編碼推定蛋白質 398 aa 且 Mra 為46.3 kDa,預計編碼推定的 IBP 結構域,SPCV-Aus1還包含一個假定的小ORF 4,位于nt 7446至7556,編碼36 aa的假定蛋白質,Mr = 4.3 kDa,但是,沒有發現保守結構域。

這種小ORF的位置類似于SPCV-Mad1序列中鑒定的小ORF(稱為ORFa),這也在CsVMV和EpV-4的基因組中被預測。

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這些資訊将更新澳洲甘薯産業的生物安全狀況,并加強目前為清潔種植材料的測試和生産制定診斷協定的努力。

甘薯起源于中美洲和南美洲,後來被波利尼西亞和歐洲航海者轉移到整個太平洋地區和亞洲,雖然SPCV-Aus<>序列與SPCV的中美洲分離株最相似,但SPCV-Aus序列與來自非洲和葡萄牙的分離株更密切相關。

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由于甘薯病毒在種植材料中普遍存在,是以這兩種分離株很可能是從不同地點引入的,雖然已知Beni-Aka材料是從亞洲進口的,但目前沒有序列資訊可以确認世界這一地區是否存在類似的分離株。

Alleys-Red植物材料的起源尚不清楚,但可以推測它來自非洲或葡萄牙,或者與具有相關序列的栽培品種來自同一地點,進入澳洲的順序隻能通過進一步描述全球SPCV多樣性來确定。

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