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澳大利亚甘薯共生病毒(SPCV)分离株的特征分析

作者:霁夜谈
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澳大利亚甘薯共生病毒(SPCV)分离株的特征分析

甘薯共体病毒(SPCV)是Caulimoviridae科Cavemovirus属的成员,仅报道了一个全长基因组序列。

SPCV于2007年在澳大利亚首次使用国际马铃薯中心(CIP)开发的硝酸纤维素膜ELISA试剂盒在两种甘薯种质中检测到。

受感染的植物还显示含有~50nm的等距病毒粒子,这是洞穴病毒,花椰菜病毒,Petuvirus和大豆病毒属的典型成员。

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我们现在已经使用下一代测序和PCR / Sanger测序的组合对两种SPCV分离株(指定为SPCV-Aus1和-Aus2)的完整基因组进行了测序和表征,两种分离株的序列编码三种主要的ORF,具有洞穴病毒典型的基因组组织。

然而,与SPCV-Aus2(7275 bp)相比,分离株SPCV-Aus1具有7712 bp的基因组长度相当短,并且是葡萄牙分离株(7723 bp;基因银行入库号NC_015328);此外,SPCV-Aus1的ORF 2比SPCV-Aus1和SPCV-Mad1的ORF 1长度短得多。

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系统发育和PASC分析表明,SPCV-Aus1与北美和中美洲的SPCV分离株密切相关,而SPCV-Aus2与葡萄牙和非洲的分离株聚集在一起。

甘薯是一种重要的块根作物,在全球粮食作物产量中排名第七,年产量约为90万吨,近年来,澳大利亚的甘薯产量大幅增加。

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从1990年的约6,000吨增加到2019年的78,000吨以上,对甘薯的需求增加和农艺实践的改进促进了产量的增长,包括在1980年代引进新品种,生产系统的机械化,以及在2000年代初引入病原体检测计划,为甘薯种植者提供了随时获得清洁种植材料的途径。

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病毒感染是全球甘薯生产的主要制约因素之一,由于甘薯繁殖的营养性质,病原体积累发生在连续的繁殖周期中,在全球范围内,人们一直在努力鉴定和表征感染甘薯的病毒,以及可能的植物卫生过程,以支持种质资源的安全交换。

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经病原体测试的清洁种植材料的可用性,将限制病毒传播到新地区并提高产量。

全球甘薯报告了 2020 多种不同的病毒;然而,其中只有五种,即甘薯羽毛斑驳病毒 (SPFMV)、甘薯病毒 2 (SPV2011)、甘薯氯斑病病毒 (SPCFV)、甘薯卷叶病毒 (SPLCV) 和甘薯共体病毒 (SPCV)。

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甘薯共体病毒(SPCV)(洞穴病毒属,Caulimoviridae科),以前称为甘薯花椰菜样病毒(SPCaLV),于1987年(首次发现,此前观察到来自波多黎各的甘薯直径约50纳米的等距颗粒,这些颗粒可移植到指示宿主)。

此后,在几个南太平洋国家(巴布亚新几内亚、汤加和所罗门群岛)、新西兰、加勒比群岛、中美洲、中国、埃及、肯尼亚、葡萄牙和乌干达的甘薯中发现了SPCV。

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然而,仅报道了一个源自葡萄牙的SPCV完整基因组序列(GenBank加入NC_015328),以及698912个SPCV部分复制酶序列(GenBank加入HQ698920 – HQ2011)和一个部分外壳蛋白序列。

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SPCV 是继模式种木薯静脉花叶病毒 (CsVMV) 之后表征的洞穴病毒属的第二个成员,最近从仙人掌和菊苣中描述了另外两种假定的洞穴病毒物种,分别暂定名为“附叶病毒 4”(EpV-4)和“菊苣花叶洞穴病毒”(ChiMV)。

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SPCV通常在甘薯中以无症状感染的形式发生,迄今为止尚未发现昆虫媒介。

然而,SPCV移植到指示植物setosa诱导小的氯斑和斑点导致坏死,SPCV 具有约 7.7 kb 的 dsDNA 基因组,具有四个开放阅读框 (ORF) 和一个大的基因间区域,其中位于基因组前 RNA 启动子、RNA 聚腺苷酸化信号和负义链引物结合位点。

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ORF 1编码一种多功能蛋白,该蛋白被切割成两个功能亚基,包括外壳蛋白(CP)和运动蛋白(MP),ORF 2编码第二种多蛋白,该多蛋白被切割成天冬氨酸蛋白酶(AP),核糖核酸酶H(RNase H)和逆转录酶(RT)。

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这是所有Caulimoviridae成员的典型特征,而ORF 3编码推定的包涵体蛋白(IBP);此外,还预测了小的第四ORF(ORFa),但没有已知的功能。

有趣的是,SPCV,ChiMV和EpV-4的基因组组织与CsVMV略有不同,CsVMV在CP / MP编码ORF和AP / RT / RNaseH编码ORF之间有一个未知功能的小ORF。

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2007年,农业和渔业部(DAF)、加顿研究设施(GRF)通过对甘薯种质的常规病原体检测,首次在澳大利亚从两个甘薯品种中鉴定出SPCV,即GRF0085/Alleys-Red(从凯恩斯新鲜食品市场收集)和GRF0069/Beni-Aka(从日本进口,位于DAF雷德兰兹研究设施的田间收集中)。

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在温室实验中将两种甘薯种质嫁接到 setosa上,诱导SPCV感染的典型叶片症状,包括环脉间绿斑和坏死斑点。1a-b),随后使用秘鲁国际马铃薯中心(CIP)开发的硝酸纤维素膜ELISA(NCM-ELISA)试剂盒检测出来自 setosa的叶组织对SPCV呈阳性。

在这里,我们描述了表征两种SPCV分离株的进一步工作,包括确定颗粒形态和细胞病理学作用的显微镜以及两种分离株的完整基因组的分子分析。

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澳大利亚甘薯共体病毒(SPCV)分离株的特征a, 用感染分离物Beni-Aka的甘薯接穗嫁接的Ipomea setosa叶片中的SPCV感染症状,用感染分离小巷-红的甘薯接穗嫁接的 setosa 叶片中 SPCV 感染的症状硝酸纤维素膜 ELISA 。

显示从健康的、小巷红 (AR) 或贝尼-阿卡 (BA) 感染的setosa 植物的重复叶片样品中检测到 SPCV——“老”和“幼”分别表示来自植物下部或上部的叶子。

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感染了分离物Beni-Aka的I. setosa叶组织的超薄组织切片的透射电子显微照片,显示感染细胞的细胞质中的病毒粒子(Bar = 200 nm) 用 2% 磷钨酸 (pH 7) 负染色的 SPCV 分离物 Beni-Aka 感染的 I. setosa 纯化的病毒样颗粒的透射电子显微照片。

使用 SPCV-Aus1000 和 SPCV-Aus7 ORF 1 的部分,复制酶序列在 MEGA2 中生成的最大似然系统发育树(2 个自举重复)(木薯静脉花叶病毒(CsVMV),被用作外组。

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来自嫁接的I. setosa植物的叶组织用于电子显微镜研究,以鉴定受感染植物细胞中的病毒颗粒,为了检测病毒粒子的存在,从健康和接枝接种的I. setosa叶组织样品中切割超薄切片(约50-60nm)。

用乙酸铀酰/柠檬酸铅染色,并通过透射电子显微镜(TEM)在JEOL 1200EX透射电子显微镜下检查80 kV,在I. setosa植物的切片中观察到大量直径~50nm的等距颗粒,这些颗粒嫁接了来自Alleys-Red和Beni-Aka的接穗)。

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随后基本上如Hull等人所述,从甘薯和I. setosa的叶子中纯化病毒粒子,并在用2%磷钨酸(pH 7)进行阴性染色后通过电子显微镜检查;当用TEM检查病毒粒子制剂时,在甘薯和I. setosa制剂的提取物中观察到许多规则的二十面体颗粒,平均直径~50nm。

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然后使用两个受感染甘薯品种的叶片组织进行全核酸提取(TNA)、滚圈扩增(RCA)和二代测序(NGS);简而言之,如Kleinow等人所述,从2009mg受感染的甘薯叶组织中分离出TNA,随后使用 2.5 μM 的核酸外切酶抗性随机六聚体(澳大利亚赛默飞世尔科技)进行 RCA,如 Sukal 等人所述。

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未消化的RCA产物使用Illustra™ GFX™ PCR DNA和凝胶带纯化试剂盒(GE Healthcare)纯化,并发送到Macrogen使用Nextera™ XT样品制备试剂盒(Illumina)进行文库制备,并使用Illumina MiSeq平台进行测序。

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Alleys-Red和Beni-Aka样品分别获得了2,585,444和2,279,642个配对端读数;使用FastQC v0.10.1评估MiSeq读取的质量,修剪残余适配器序列。

以及使用Geneious v30.40.11 中的Bbbduk插件删除了低质量(Q < 0)和短读数质量校正的读取是使用嵌入式Genious汇编器从头组装的,随后,BLASTn 用于根据本地 RefSeq 病毒数据库查询大小 bp 的从头组装重叠群。

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这项工作报告了第一个从澳大利亚表征的全长SPCV分离株,补充了目前可用的SPCV的单一已发表的全长基因组序列,对这些新的完整序列的分析证实了SPCV-Mad1的基因组组织,其与CsVMV(洞穴病毒属的类型成员)略有不同。

在现有的三种完全测序的SPCV分离株中没有发现小的ORF2,同样,最近报道的 ChiMV 和 EpV-4 也与三个完全表征的 SPCV 基因组序列具有相同的预测基因组组织。

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使用SPCV-Aus864和SPCV-Aus1的部分复制酶序列以及GenBank和CsVMV提供的其他SPCV序列(加入NC001648)进行系统发育分析,MEGA7用于将 ClustalW 的序列与默认设置对齐,并使用最大似然 (ML) 方法生成的系统发育树,基于 Kimura-2 参数模型遵循最近邻交换 ML 启发式方法。

具有1000次自举复制用于生成树,系统发育分析表明,SPCV-Aus1与北美和中美洲的SPCV分离株一起,与墨西哥的Mex183和古巴的Cub44的分离株关系最密切。

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相比之下,SPCV-Aus2与SPCV-Mad1和来自非洲的1个分离株聚集在一起,来自危地马拉(Gua154和Gua128)和巴拿马(Pan1)的分离株形成了一个独特的亚群,似乎是迄今为止测序的其他SPCV分离株组成的两个亚群的祖先这些结果证实了澳大利亚甘薯中存在SPCV分离株,并将现在可用的全长序列数量从1个增加到2019个。

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SPCV-Aus1的ORF 1定位从nt 54到3,839,编码1,261 aa的假定蛋白质,Mr为149.8 kDa,并包含预测的CP和MP结构域,ORF 2 定位于 nt 3832 至 5757 编码推定蛋白质 641 aa,Mr为 75.6 kDa,包含 AP、RT 和 RNase H 结构域。

而 ORF 3 位于 nt 5687 至 6883 并编码推定蛋白质 398 aa 且 Mra 为46.3 kDa,预计编码推定的 IBP 结构域,SPCV-Aus1还包含一个假定的小ORF 4,位于nt 7446至7556,编码36 aa的假定蛋白质,Mr = 4.3 kDa,但是,没有发现保守结构域。

这种小ORF的位置类似于SPCV-Mad1序列中鉴定的小ORF(称为ORFa),这也在CsVMV和EpV-4的基因组中被预测。

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这些信息将更新澳大利亚甘薯产业的生物安全状况,并加强目前为清洁种植材料的测试和生产制定诊断协议的努力。

甘薯起源于中美洲和南美洲,后来被波利尼西亚和欧洲航海者转移到整个太平洋地区和亚洲,虽然SPCV-Aus<>序列与SPCV的中美洲分离株最相似,但SPCV-Aus序列与来自非洲和葡萄牙的分离株更密切相关。

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由于甘薯病毒在种植材料中普遍存在,因此这两种分离株很可能是从不同地点引入的,虽然已知Beni-Aka材料是从亚洲进口的,但目前没有序列信息可以确认世界这一地区是否存在类似的分离株。

Alleys-Red植物材料的起源尚不清楚,但可以推测它来自非洲或葡萄牙,或者与具有相关序列的栽培品种来自同一地点,进入澳大利亚的顺序只能通过进一步描述全球SPCV多样性来确定。

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