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巨噬細胞在異物反應和傷口愈合等發炎過程的啟動、維持和過渡中至關重要。越來越多的證據表明，實體因素在體外和體内也調節巨噬細胞的活化。2D體外系統已經證明，将巨噬細胞限制在小區域或通道可以調節其表型，并改變其對已知的發炎因子如脂多糖的反應。然而，次元和孔徑如何影響巨噬細胞表型的研究較少。
是以，來自杜克大學的Tatiana Segura及其團隊于2023年5月15日在《Advanced Healthcare Materials》發表題為“Spatial confinement modulates macrophage response in microporous annealed particle (MAP) scaffolds”的研究論文，揭示了當巨噬細胞被限制在微孔退火顆粒支架(MAP)中時，M1/M2的極化發生變化。
1. LOVAMAP指導設計具有可控三維孔徑的MAP支架（圖1）
為了建立小鼠骨髓來源巨噬細胞(BMDM)所需空間限制程度的MAP支架，本文使用LOVAMAP指導設計具有可控三維孔徑的MAP支架。首先使用Side FX霍迪尼軟體模拟具有不同微凝膠尺寸(從40 μm到200 μm)的單分散MAP支架陣列，然後使用顆粒材料内部分析軟體LOVAMAP25提取三維孔隙資料。3D孔體積被用作空間限制程度的近似，因為孔體積直接影響支架内包裹的細胞體積。之前關于BMDM限制的2D和2.5 D研究報道，巨噬細胞限制發生在體積小于4.2 pL的空間。是以，本文選擇直徑為40 μm的顆粒制成的支架作為限制條件，選擇含有130 μm直徑顆粒的MAP支架作為非限制條件。這些130 μm的顆粒也是最大的尺寸，可以通過29和31 Gauge注射器針頭進行無變形的體内支架注射。此外，選擇了一個較小的限制組，使用具有70 μm直徑顆粒的MAP支架，其具有與未處理的BMDM相比對的中值孔體積(15.8 pL)。
使用微流控裝置，生成了平均直徑為40 μm、70 μm和130 μm的微凝膠。這些微凝膠由相同的化學成分組成，具有相似的機械性能。當它們一起退火形成MAP支架時，産生了具有相似空隙率(25-35 %)但内部形貌明顯不同的支架。再次，利用LOVAMAP，分析了實驗室制備的MAP支架的顯微熒光圖像，以估計實際的3D孔參數，發現與模拟資料相似。實驗室制備的MAP支架的三維孔徑分布分析受到共聚焦圖像采集和光散射的限制。此外，圖像邊界會導緻顆粒和孔隙被剪斷并延伸到感興趣區域之外，進而導緻孔隙尺寸的低估。然而，對于40、70和130 μm，3D孔徑的中位數分别為4.2、11.5和71.8 pL，這與模拟資料相比對，表明可以通過改變微凝膠尺寸來控制MAP支架中的3D孔徑。
圖1 LOVAMAP軟體指導設計了3D孔徑可控的MAP GELS
2. 在MAP支架中，巨噬細胞在空間限制下顯示出發散的核形狀（圖2）
進一步觀察了包裹細胞的細胞核形狀，因為它與細胞表型和激活狀态有關。以往的研究也表明，細胞形狀的改變會導緻細胞核形态的改變，進而引起核組分的重組。毫不奇怪，本研究的細胞形态的大小依賴性變化反映在細胞核形狀的變化上。130μm MAP支架中的BMDM具有更大的細胞核面積，40 μm和130 μm MAP支架中的BMDMs具有更小的圓形細胞核形狀和更高的長徑比。在40 μm和130 μm的MAP支架中，細胞伸長的增加與更長的細胞核形狀有關，這與更高的染色質凝聚群組蛋白乙酰化程度有關。細胞形态參數與細胞核形狀之間的相關矩陣顯示，較大的細胞中觀察到較大的細胞核。細胞核的類似性參數，如圓形度、實心度與細胞的球形度呈高度正相關，進一步證明了細胞形态與細胞核形狀之間的正互相作用。
圖2 在MAP GELS中，巨噬細胞在空間限制下表現出不同的形态
3. 巨噬細胞抗原呈遞标志物在LPS/IFN-γ或IL-4刺激下存在差異（圖3）
通過ELISA定量發炎細胞因子分泌、流式細胞術分析發炎标志物，分析2D培養的巨噬細胞在M1(LPS/IFN-γ)或M2(IL-4)激活時表現出的差異。M1表型檢測IL-6、TNF細胞因子分泌以及iNOS、CD86标志物表達，M2表型及J檢測Arg1、CD206标志物表達。此外，抗原提呈特性用MHCII和CD11c表達檢測。正如預期的那樣，M1(LPS/IFN-γ)刺激增加了IL-6和TNF的分泌以及促炎标志物iNOS和CD86的表達，MHCII表達也上調。另一方面，用M2(IL-4)刺激巨噬細胞，并不能誘導IL-6和TNF的分泌，而是上調CD206和Arg1的表達，同時CD11c表達上調。
圖3 在MAP支架中，巨噬細胞在空間限制下顯示出發散的核形狀
4. MAP支架中LPS/IFN-γ刺激的巨噬細胞發炎反應降低（圖4）
文獻報道，通過拓撲結構設計迫使巨噬細胞變成細長的細胞形狀促進M2極化，在空間上限制巨噬細胞可降低其LPS發炎反應。在有M2(IL-4)刺激或無刺激的MAP支架中激活巨噬細胞并不會導緻明顯的M2極化。另一方面，M1(LPS/IFN-γ)激活導緻巨噬細胞發炎反應降低，所有MAP支架組的iNOS、CD86、IL-6和TNF細胞因子表達均顯著降低。表明将BMDM限制在40 ~ 130 μm微凝膠組裝的MAP支架中，改變了其發炎表型。
圖4 空間限制巨噬細胞的表型變化
5. 在MAP支架中培養的巨噬細胞與2D相比其抗原提呈作用發生改變（圖4）
在2D培養實驗中，巨噬細胞在M1(LPS/IFN-γ)刺激下MHCII表達上調。然而，在不同MAP支架組培養的BMDM之間MHCⅡ表達沒有差異，表明所測試的3D孔徑大小不影響MHCⅡ表達。在2D中，盡管IL-4處理組CD11c表達上調，但在MAP支架中，M1(LPS/IFN-γ)刺激後所有BMDM的CD11c表達均較高，且高于IL-4處理的MAP支架組。這些結果表明，在MAP支架中培養的細胞在細胞因子刺激後其CD11c的表達發生了顯著變化。
6. 在MAP中觀察到細胞形态與細胞表型變化的相關性（圖4）
與細胞形态和微凝膠尺寸的相關性分析類似，我們使用皮爾森相關矩陣來揭示細胞形态、MAP支架尺寸和内化以及巨噬細胞表型與M1(LPS/IFN-γ)刺激之間的相關性。隻有CD11c與微凝膠的大小呈高度負相關。有趣的是，iNOS和CD206均與細胞/細胞核的球形度呈高度正相關，與細胞面積呈負相關。這意味着更小、形狀更圓的細胞與更高的iNOS、CD206表達相關。然而，在肺泡巨噬細胞中觀察到的結果相反，在肺泡巨噬細胞中大細胞表達較高CD206。同樣，CD86與細胞核球形度呈正相關。兩種促炎細胞因子都與細胞核的圓形性相關。研究結果表明，MAP支架的空間限域通過激活M1(LPS/IFN-γ)調節巨噬細胞表型。
7. MAP支架中M1活化後M1/M2亞型的平衡（圖5）
BMDM中Arg1、CD206和CD11c表達的基礎水準是由于使用的分化方法，該方法誘導了較低的發炎、促再生表型。在每個治療條件下使用2D培養的巨噬細胞作為參考，以确定與治療相關的主要細胞類型。與2D組相比，在在40 μm和130 μm的MAP支架中培養的巨噬細胞M1(LPS/IFN-γ)活化表現為雙陽性促炎标志物(iNOS+CD86+)減少，在40 μm的MAP支架中M1/M2亞型(CD206+iNOS+)減少。這些結果與40 μmMAP支架中M1/M2亞型(Arg1+iNOS+)和雙陽性促再生标志物(iNOS+CD86+)的增加相一緻。相關矩陣顯示M1/M2亞型(CD206+iNOS+)和雙陽性促炎标志物(iNOS+CD86+)之間存在高度正相關關系。這種相關性表明高表達iNOS的巨噬細胞亞群，同時表達CD206和CD86。CD206+CD11c +和CD206 +CD86 +共表達之間存在負相關，表明MAP支架調節巨噬細胞對M1刺激的反應，使其具有更強的再生和抗原提呈表型。同樣，共表達CD206+MHCII+與微凝膠大小呈負相關，與CD11c +的表達和細胞的橢圓形性高度相關。總之，MAP支架中的巨噬細胞表型景觀是由3D孔徑形成的，并且MAP支架組對M1活化的反應明顯較低，具有更強的促再生和抗原呈遞表型。
圖5 在MAP支架中觀察到M1活化時M1/M2亞型的平衡
8. 空間限制通過改變細胞運動軌迹和速度影響巨噬細胞運動（圖6）
巨噬細胞在體内充當哨兵細胞，非常活躍，動态檢測我們的身體。接下來。可視化巨噬細胞在的MAP支架中的運動，并确定3D孔徑是否影響它們的運動。當巨噬細胞被封裝在類似MAP支架的3D支架中時，他們通過在3D孔内和跨3D孔的移動以及對微凝膠表面的傳感來主動探索MAP支架的空隙空間。在40 μm的MAP支架中，巨噬細胞包裹在小微凝膠周圍，呈圓形運動。在70 μm的MAP支架中，大多數巨噬細胞定居在3D孔的口袋中，并在微凝膠表面從側面移動；部分巨噬細胞通過内部門從一個3D孔遷移到相鄰的3D孔。130 μm MAP支架中細胞運動最不穩定，巨噬細胞在130 μm MAP支架中頻繁地沿微凝膠表面穿行，穿過内部門進入鄰近的3D孔。通過示蹤細胞位移，我們發現130 μm的MAP支架對細胞運動的限制最小，而40 μm和70 μm的MAP支架中巨噬細胞的運動僅限于局部的3D孔隙。130 μm MAP支架對激活相關的細胞運動增加的限制最小，導緻最大的最大行程距離和中值速度。相關矩陣顯示細胞運動的中值速度和最大距離與MAP支架的微凝膠尺寸和細胞/細胞核的形狀高度相關。較大的3D孔徑允許細胞自由移動并使其形态适應環境。相比之下，細胞中的橢圓形(長橢圓形)和細胞/細胞核中的球形度與細胞運動參數表現出負相關作用，表明較小的圓形細胞傾向于移動小于鋪展的細胞。結果表明，不同MAP支架施加的3D孔徑通過改變細胞運動軌迹和速度影響巨噬細胞運動。
圖6 空間限制通過改變細胞運動軌迹和速度影響巨噬細胞運動
9. 巨噬細胞表型在體内和體外實驗中表現出相似的模式（圖7）
最後，在皮下種植模型中對浸潤的巨噬細胞進行表征。每隻小鼠背部注射3次50 μL水凝膠(40 μm、70 μm和130 μm MAP支架各1個)。植入後7天，分析巨噬細胞表型(CD11b+F4/80+)。4種胞外染色标記物CD86、CD206、MHCⅡ和CD11c用于表征巨噬細胞表型。選擇該時間點探讨異物反應急性期與晚期發炎期的交界點。所有MAP支架組的總浸潤活細胞數和CD45+細胞數相似，說明較小的孔徑并沒有對細胞浸潤形成明顯的屏障。巨噬細胞的百分比有尺寸依賴性的增加，130 μm的MAP支架具有更高的巨噬細胞數量，這可能是由于巨噬細胞在所有免疫細胞中的細胞尺寸更大。與體外結果相似，與40 μm和130 μm的MAP支架相比，70 μm MAP支架促進了CD206的表達。CD86、MHCI、CD11c在所有MAP支架組中表達相似。比較體外和體内結果，皮爾森相關矩陣顯示巨噬細胞表型相似，表明體外結果預測了體内巨噬細胞的活化。對所有MAP支架的總體免疫反應是積極的、具有建設性的，導緻所有植入物均血管化，植入21天後，細胞面積百分比增加主要集中在70 μm的MAP支架中。
圖7 巨噬細胞表型在體内和體外實驗中表現出相似的模式
越來越多的證據支援實體因素在調節巨噬細胞活化中的重要作用。通過孔徑和生物材料内部景觀的空間限制被證明可以抑制2D系統中巨噬細胞LPS相關的發炎反應。對空間限制如何在3D環境中調節巨噬細胞活化的深入了解，本研究能夠設計更多可翻譯的生物材料用于臨床應用。
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