cerna(測rna濃度260280比值大于2)

如何做環狀RNA的功能驗證

環狀RNA：

動物體内的環狀RNA(Circular RNA,CircRNA)是一類具有特殊未知功能的RNA，而且是客觀大量存在的。

環狀RNA由前體RNA通過剪切，然後由線性RNA的頭對尾連接配接形成，以前的研究由于技術水準的限制，把

這部分客觀存在的RNA忽略了，随着深度RNA測序及規模化生物資訊技術的發展，研究者才真正發現在生

物體内大量存在環狀的RNA分子，環狀RNA由于形成閉合的環狀，在生物體内非常的穩定。

重要作用及研究意義：

在對circRNA 結構和功能研究的基礎上，有研究人員發現它們在動脈粥樣硬化，神經系統紊亂，糖尿病和

惡性良性腫瘤等疾病發生過程中，發揮非常重要的作用。對環狀RNA研究具有重要的意義:

1)circRNA獨具的競争性内源(ceRNA)特征可為藥物開發提供新的思路；

2)circRNA的組織特異性和穩定性有可能使circRNA成為一種良好的生物标志物；

3) circRNA 的研究為生命的進化研究提供新的方向。

功能特征：

對于環狀RNA的具體功能尚未有明确研究報道，目前隻有幾種假定的說法:

1)circRNA可以作為“sponge”海綿吸miRNA ，抑制其功能； 

2) circRNA通過堿基互補配對直接調控其他RNA水準； 

3)circRNA能與蛋白質結合, 抑制蛋白質活性、募集蛋白質複合體的組分或調控蛋白質的活性；

4)circRNA也可作為翻譯的模闆指導蛋白質的合成。

研究政策：

一、環狀RNA确定與篩選

1)環狀RNA生物資訊學預測

2) 環狀RNA高通量測序

3)環狀RNA表達豐度檢測

4)FISH 檢測環狀RNA的亞細胞定位

5)NorthernBlot 檢測環化RNA的存在

二、環狀RNA的功能研究

1)環狀RNA的過表達實驗(Gain of function)

2)環狀RNA功能缺失實驗(Loss of function )

三、環狀RNA的表達調控

1)環狀RNA與miRNA互作結合生物預測及實驗驗證

2)環狀RNA與miRNA互相作用預測研究 

3)環狀RNA與蛋白互相作用研究随着去除核糖體測序技術深入發展，越來越多的環狀RNA(circRNA)不斷報道發現，基于生物資訊學分析顯示circRNA發揮着極其重要的生物學功能。然後如何采用實驗手段進一步驗證circRNA的生物學功能顯得尤為重要，本文帶大家一起探讨circRNA功能驗證政策。

1. circRNA定量驗證

circRNA定量驗證手段與正常PCR手段不同，正常手段是圍繞目的片段的上下遊分别設計PCR引物，稱之為convergent primer，需擴增的片段位于上下遊引物之間(如圖1.1)。而對于circRNA，尤其外顯子環化circRNA，除backsplice junction位點處不同于linear RNA之外，body區與linearRNA是一緻的。是以，驗證時需要特異性針對backsplice junction位點處設計primer，稱之為divergent primer(如圖1.1)，而且設計的PCR product的長度越短越好，可以增強backsplice junction位點處擴增效率。

圖1.1 convergent primer vs divergent primer

為增強circRNA的驗證效率，起始模版需滿足以下要求(3 free)：1. DNA free；2. rRNA free；3. linearRNA free。

驗證政策：對3free RNA以及genome DNA同時進行PCR擴增，電泳檢測PCR product大小(如圖1.2)。

圖1.2 circRNA引物擴增結果

2. circRNA Northern blot驗證

Northern blot方法是一種比較古老但行之有效的序列驗證方法，需圍繞circRNA設計探針序列，而探針序列設計是驗證成功至關重要的環節。對于circRNA探針設計，我們建議以下兩點：1. 對于外顯子環化circRNA，建議探針盡可能跨backsplice junction位點；2.對内含子環化circRNA，可圍繞内含子區域設計探針。

驗證政策：對3 free RNA、total RNA以及genome DNA同時進行雜交驗證。

3. circRNA過表達

circRNA過表達思想主要源于circRNA生物形成機制，已有多篇文章報道circRNA成環機制，目前比較公認的成環機制為circRNA側翼序列的堿基互補配對，稱之為Alu結構(如圖2)。

圖2 circRNA側翼結構特征

基于circRNA側翼Alu序列特征，PCR擴增含側翼Alu序列的目标DNA序列，随後依據對應限制性内切酶位點進行酶切，進而連接配接pEGFP-C1載體。連接配接載體進而轉染對應細胞樣本，定量PCR檢測轉染效率。基于divergent primer驗證circRNA過表達倍數。

過表達政策：1. 擴增目标區域包含circRNA側翼Alu序列或内部堿基互補序列，側翼上下遊1kb處過表達效率更佳；2. 目标區域擴增基于基因組DNA為模版。

4. circRNA敲除

circRNA敲除思路主要針對circRNA backsplice junction處序列資訊設計siRNA，對于内含子環化circRNA，也可針對内含子區域設計相應siRNA進行幹擾。Divergent primer驗證circRNA敲除倍數。

敲除政策：

1. 外顯子環化circRNA，針對backsplice junction位點前後序列設計siRNA，如圖3所示；

2. 内含子環化circRNA，除針對backsplice junction位點前後序列設計siRNA序列以外，也可針對内含子區域序列設計siRNA。

3. 每個siRNA設計對應的對照，backsplice junction位點一端互補配對，另一端錯配，如圖3所示。

神秘博士第4季 old唱的歌叫什麼名字？

第十任博士挽歌

歌曲聆聽：

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原版拉丁文：

Vale Decem

Honore res quara

Emerio

Alter altera

Vale Decem

Emerio

Alter...

Alter...ie

Vale Decem

Vale Stragem

Valde Temptua

De glorio

Vale de Temptua

Valde Decet

Honora res quara

Alter cerna

Armis

Grata tunc, usquera, emani

Vale..le.. Vale..le..

Vale..le.. Vale..le..

(I don't wanna to go...)

Farewell, Ten,永别了，第十任

Because of your honour因著你無比的光榮，

It's well deserved這是你絕對應得的

This other one另一個人，

Farewell, Ten,永别了，第十任

It's well deserved這是你所絕對應得的

This other one另一個人，

This other one of you另一個的你，

Farewell, Ten,永别了，第十任

Farewell, Carnage,永别了，所有的大屠殺

Intense Trials經過激烈的考驗，

Concerning pride一個又一個涉及虛榮的考驗

Farewell to these trials永别了，這些考驗

In a very proper way在一個适當的方式之下

Because of your honour因在你的光榮之下，

This seperation這場生離死别，

Is by force of arms武力造成的分離

Flow out all the way with joy就讓一切都被歡樂所沖刷吧

Farewell...永别了！

這首歌是第十任博士重生時的音樂

一首悲哀、催人淚下的合唱音樂

是第十任博士的挽歌，亦帶領著一個時代終結

盡管第十任博士想上路，但一個永不回頭的時間領主也要繼續前行了……

更新 Song of Freedom：