該指南描述了如何使用Duolink® In Situ Probemaker将PLA寡核苷酸（PLUS或MINUS）與任何用于Duolink® PLA實驗的抗體進行偶聯。隻要是使用了PLUS PLA探針和MINUS PLA探針，Probemaker生成的PLA抗體便可與标準的Duolink® PLA探針組合或獨立使用。如需了解更多關于Probemaker應用的資訊，請通路Duolink® PLA故障排除指南中“建立您自己的PLA® 探針和Duolink® Probemaker”章節。更多内容請到默克生命科學官網檢視：www.sigmaaldrich.cn
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應用
當單獨使用目前的Duolink® PLA探針不可行或不理想時，可使用Duolink® Probemaker。本節介紹Duolink® Probemaker的常見應用。
1.使用來自相同物種的一抗
當使用來自相同物種的兩種一抗時，Duolink® Probemaker可用于将PLA PLUS寡核苷酸與其中一種抗體偶聯，而另一種則用PLA MINUS寡核苷酸進行偶聯。當僅使用直接偶聯的一抗時，則無需二抗或Duolink® PLA探針，且應跳過PLA實驗方案中的這一步。
2.使用來自任何物種的一抗
目前提供的Duolink® PLA探針是與PLA偶聯的二抗，可識别來自小鼠、兔或山羊的IgG。當使用源自小鼠、兔或山羊以外物種的兩種一抗時，Duolink® Probemaker可用于用PLA寡核苷酸标記一抗或适當的二抗。将其中一種抗體與PLA PLUS寡核苷酸偶聯，将另一種抗體與PLA MINUS寡核苷酸偶聯。
當僅有一種一抗是源于小鼠、兔或山羊以外的物種時，隻要是使用了PLUS PLA探針和MINUS PLA探針，便可使用Duolink® Probemaker生成的PLA抗體和标準Duolink® PLA探針的組合。
3.使用源自與組織樣品相同宿主物種的一抗（如“小鼠用于小鼠”）
使用源自小鼠的一抗對小鼠組織進行染色通常會導緻高背景，這是由于二抗會與待染色組織中的内源性小鼠IgG以及B細胞、漿細胞和巨噬細胞上的Fc受體結合而引起的。為了繞過抗小鼠二抗的使用并降低背景，可使用Duolink® Probemaker将源自小鼠的一抗與PLA寡核苷酸直接偶聯。
Duolink® Probemaker試劑
有關具體的産品建議，請參閱Duolink® PLA産品選擇指南。Duolink® Probemaker支援建立定制化的PLA寡核苷酸偶聯抗體，隻要是使用了PLUS PLA和MINUS PLA探針，其便可與标準的Duolink® PLA探針組合或獨立使用。每款Duolink® PLA Probemaker試劑盒都含有可偶聯20 µg濃度為1 mg/mL的抗體的試劑。這些試劑包括：
- Duolink® PLA寡核苷酸 – 一管含有凍幹、活化的寡核苷酸（PLUS或MINUS）
- 偶聯緩沖液 – 用于緩沖偶聯反應
- 終止試劑 – 用于終止偶聯反應
- 儲存溶液 – 用于儲存偶聯後的抗體（PLA探針）
- 20x 檢定試劑 – 在必要時可加入至實驗者優化的抗體稀釋液
- 封閉溶液 – 用于在一抗孵育前封閉樣品
- PLA探針稀釋液 – 用于将偶聯後的抗體（PLA探針）稀釋至最終測定濃度
說明：在-20 °C下儲存所有的試劑。抗體偶聯後，儲存在4 °C下。
其他材料
- 一抗或二抗 – 用于與PLA寡核苷酸（PLUS或MINUS）偶聯。抗體需滿足以下标準才可用于偶聯：
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待偶聯的抗體必須具有1 mg/mL的濃度。單次偶聯所需的抗體量為20 µg（=20 µL）。
說明：如果使用的是單克隆抗體，則該抗體應由Protein A或Protein G親和純化。
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抗體必須在無胺緩沖液中（最好是PBS）。緩沖液應是無載體且無儲存劑的，但可含有不超過0.1％的BSA、5％的海藻糖和0.02％的疊氮化鈉。
說明：如果不知道儲存抗體的緩沖液的組成，建議在偶聯前進行透析或更換緩沖液。
說明：不建議在Duolink® In Situ Probemaker偶聯之前對極稀的抗體進行濃縮，除非有很大的量，因為濾器型濃縮器會造成很大的損失。
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1 x PBS – 可在必要時用于抗體的緩沖液交換。建議的緩沖液交換過程如下：
說明：該過程不适用于還原高濃度的BSA或其他大分子。
說明：可以使用Microcon-10離心式濾器單元（産品編号MRCPRT010）。
- 首先用1 x PBS通過3000 rpm離心1 min而對離心柱進行預平衡，然後加入400 µL 1x PBS并再次離心1 min，重複4次。将離心柱放置到一個新的離心管中。
- 向柱中加入抗體（12–50 µL）并再次3000 rpm離心2 min。所收集抗體的濃度應通過OD進行驗證。1 mg/mL應具有1.4的OD 280 nm。
該偶聯實驗方案描述了如何将PLA寡核苷酸（PLUS或MINUS）與任何抗體偶聯。開始之前，確定待偶聯抗體在無胺緩沖液中的濃度為1 mg/mL。該抗體緩沖液應是無載體且無保護劑的，但可含有不超過0.1％的BSA、5％的海藻糖和0.02％的疊氮化鈉。在使用前将所有的液體試劑進行渦旋。
- 将2 µL偶聯緩沖液加入至20 µL的待偶聯抗體中。抗體濃度應為1 mg/mL。
- 緩慢吹打混勻。
-
将抗體溶液轉移至一管凍幹的寡核苷酸（PLUS或MINUS）中。
說明：在打開凍幹寡核苷酸的小管後立即加入抗體溶液。
- 緩慢吹打混勻。
- 室溫孵育過夜。
- 向反應中加入2 µL終止試劑。
- 室溫孵育30分鐘。
- 加入24 µL儲存溶液，以及其他必要的試劑來穩定特定的抗體。
- 在穩定完成後，PLA探針可4 °C儲存在儲存溶液中。
隻要是使用了PLUS PLA和MINUS PLA偶聯的抗體，Duolink® PLA熒光實驗方案或Duolink® PLA明場實驗方案便可使用與Duolink® PLA探針組合或獨立使用的Probemarker生成的抗體。請注意以下更改可能會影響到基于您PLA探針的實驗：
- 應使用Probemarker試劑盒中的PLA探針稀釋液取代熒光和明場實驗方案中的Duolink®抗體稀釋液。
- 可選：當使用定制抗體稀釋液而非提供的PLA探針稀釋液時，建議在使用PLA偶聯抗體前用您的定制抗體稀釋液按1:20将20x 檢定試劑進行稀釋。
- 在熒光和明場實驗方案中相應的正确步驟進行PLA偶聯抗體的孵育。如果采用一抗進行偶聯，則在一抗孵育步驟（熒光第2步；明場第3步）使用它們。如果采用二抗進行偶聯，則在PLA探針孵育步驟（熒光第3步；明場第4步）使用它們。
- 當僅使用直接偶聯的一抗時，無需二抗或Duolink® PLA探針。是以，可跳過熒光和明場實驗方案中的PLA探針孵育步驟（分别是第3步和第4步）。對于任何其他的PLA探針組合，實驗方案都應按此進行。
請參閱Duolink® PLA故障排除指南查找故障排除的提示和技巧、一般故障排除說明、以及常見問題解答。
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