该指南描述了如何使用Duolink® In Situ Probemaker将PLA寡核苷酸（PLUS或MINUS）与任何用于Duolink® PLA实验的抗体进行偶联。只要是使用了PLUS PLA探针和MINUS PLA探针，Probemaker生成的PLA抗体便可与标准的Duolink® PLA探针组合或独立使用。如需了解更多关于Probemaker应用的信息，请访问Duolink® PLA故障排除指南中“创建您自己的PLA® 探针和Duolink® Probemaker”章节。更多内容请到默克生命科学官网查看：www.sigmaaldrich.cn
如想了解Duolink® PLA技术，请下载我们的手册并查阅如何优化Duolink® 邻位连接测定以获得更多详细信息。可在Duolink®资源中心获取Duolink® PLA实验方案以及使用Probemarker生成的PLA抗体所需的其他Duolink® PLA试剂的相关信息。
应用
当单独使用当前的Duolink® PLA探针不可行或不理想时，可使用Duolink® Probemaker。本节介绍Duolink® Probemaker的常见应用。
1.使用来自相同物种的一抗
当使用来自相同物种的两种一抗时，Duolink® Probemaker可用于将PLA PLUS寡核苷酸与其中一种抗体偶联，而另一种则用PLA MINUS寡核苷酸进行偶联。当仅使用直接偶联的一抗时，则无需二抗或Duolink® PLA探针，且应跳过PLA实验方案中的这一步。
2.使用来自任何物种的一抗
当前提供的Duolink® PLA探针是与PLA偶联的二抗，可识别来自小鼠、兔或山羊的IgG。当使用源自小鼠、兔或山羊以外物种的两种一抗时，Duolink® Probemaker可用于用PLA寡核苷酸标记一抗或适当的二抗。将其中一种抗体与PLA PLUS寡核苷酸偶联，将另一种抗体与PLA MINUS寡核苷酸偶联。
当仅有一种一抗是源于小鼠、兔或山羊以外的物种时，只要是使用了PLUS PLA探针和MINUS PLA探针，便可使用Duolink® Probemaker生成的PLA抗体和标准Duolink® PLA探针的组合。
3.使用源自与组织样品相同宿主物种的一抗（如“小鼠用于小鼠”）
使用源自小鼠的一抗对小鼠组织进行染色通常会导致高背景，这是由于二抗会与待染色组织中的内源性小鼠IgG以及B细胞、浆细胞和巨噬细胞上的Fc受体结合而引起的。为了绕过抗小鼠二抗的使用并降低背景，可使用Duolink® Probemaker将源自小鼠的一抗与PLA寡核苷酸直接偶联。
Duolink® Probemaker试剂
有关具体的产品建议，请参阅Duolink® PLA产品选择指南。Duolink® Probemaker支持创建定制化的PLA寡核苷酸偶联抗体，只要是使用了PLUS PLA和MINUS PLA探针，其便可与标准的Duolink® PLA探针组合或独立使用。每款Duolink® PLA Probemaker试剂盒都含有可偶联20 µg浓度为1 mg/mL的抗体的试剂。这些试剂包括：
- Duolink® PLA寡核苷酸 – 一管含有冻干、活化的寡核苷酸（PLUS或MINUS）
- 偶联缓冲液 – 用于缓冲偶联反应
- 终止试剂 – 用于终止偶联反应
- 储存溶液 – 用于保存偶联后的抗体（PLA探针）
- 20x 检定试剂 – 在必要时可加入至实验者优化的抗体稀释液
- 封闭溶液 – 用于在一抗孵育前封闭样品
- PLA探针稀释液 – 用于将偶联后的抗体（PLA探针）稀释至最终测定浓度
说明：在-20 °C下保存所有的试剂。抗体偶联后，保存在4 °C下。
其他材料
- 一抗或二抗 – 用于与PLA寡核苷酸（PLUS或MINUS）偶联。抗体需满足以下标准才可用于偶联：
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待偶联的抗体必须具有1 mg/mL的浓度。单次偶联所需的抗体量为20 µg（=20 µL）。
说明：如果使用的是单克隆抗体，则该抗体应由Protein A或Protein G亲和纯化。
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抗体必须在无胺缓冲液中（最好是PBS）。缓冲液应是无载体且无保存剂的，但可含有不超过0.1％的BSA、5％的海藻糖和0.02％的叠氮化钠。
说明：如果不知道保存抗体的缓冲液的组成，建议在偶联前进行透析或更换缓冲液。
说明：不建议在Duolink® In Situ Probemaker偶联之前对极稀的抗体进行浓缩，除非有很大的量，因为滤器型浓缩器会造成很大的损失。
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1 x PBS – 可在必要时用于抗体的缓冲液交换。建议的缓冲液交换过程如下：
说明：该过程不适用于还原高浓度的BSA或其他大分子。
说明：可以使用Microcon-10离心式滤器单元（产品编号MRCPRT010）。
- 首先用1 x PBS通过3000 rpm离心1 min而对离心柱进行预平衡，然后加入400 µL 1x PBS并再次离心1 min，重复4次。将离心柱放置到一个新的离心管中。
- 向柱中加入抗体（12–50 µL）并再次3000 rpm离心2 min。所收集抗体的浓度应通过OD进行验证。1 mg/mL应具有1.4的OD 280 nm。
该偶联实验方案描述了如何将PLA寡核苷酸（PLUS或MINUS）与任何抗体偶联。开始之前，确保待偶联抗体在无胺缓冲液中的浓度为1 mg/mL。该抗体缓冲液应是无载体且无保护剂的，但可含有不超过0.1％的BSA、5％的海藻糖和0.02％的叠氮化钠。在使用前将所有的液体试剂进行涡旋。
- 将2 µL偶联缓冲液加入至20 µL的待偶联抗体中。抗体浓度应为1 mg/mL。
- 缓慢吹打混匀。
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将抗体溶液转移至一管冻干的寡核苷酸（PLUS或MINUS）中。
说明：在打开冻干寡核苷酸的小管后立即加入抗体溶液。
- 缓慢吹打混匀。
- 室温孵育过夜。
- 向反应中加入2 µL终止试剂。
- 室温孵育30分钟。
- 加入24 µL储存溶液，以及其他必要的试剂来稳定特定的抗体。
- 在稳定完成后，PLA探针可4 °C保存在储存溶液中。
只要是使用了PLUS PLA和MINUS PLA偶联的抗体，Duolink® PLA荧光实验方案或Duolink® PLA明场实验方案便可使用与Duolink® PLA探针组合或独立使用的Probemarker生成的抗体。请注意以下更改可能会影响到基于您PLA探针的实验：
- 应使用Probemarker试剂盒中的PLA探针稀释液取代荧光和明场实验方案中的Duolink®抗体稀释液。
- 可选：当使用定制抗体稀释液而非提供的PLA探针稀释液时，建议在使用PLA偶联抗体前用您的定制抗体稀释液按1:20将20x 检定试剂进行稀释。
- 在荧光和明场实验方案中相应的正确步骤进行PLA偶联抗体的孵育。如果采用一抗进行偶联，则在一抗孵育步骤（荧光第2步；明场第3步）使用它们。如果采用二抗进行偶联，则在PLA探针孵育步骤（荧光第3步；明场第4步）使用它们。
- 当仅使用直接偶联的一抗时，无需二抗或Duolink® PLA探针。因此，可跳过荧光和明场实验方案中的PLA探针孵育步骤（分别是第3步和第4步）。对于任何其他的PLA探针组合，实验方案都应按此进行。
请参阅Duolink® PLA故障排除指南查找故障排除的提示和技巧、一般故障排除说明、以及常见问题解答。
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