默克生命科學 | TRI Reagent®實驗方案

TRI Reagent

TRI Reagent®溶液（也以TRIzol的名稱出售）是硫氰酸胍和苯酚的單相溶液混合物，可用于從人、動物、植物、酵母、細菌和病毒生物樣品中分離DNA、RNA和蛋白質。其可抑制RNase活性。TRI Reagent®用于勻漿提取RNA、DNA或蛋白質的生物樣品。更多内容請到默克生命科學官網檢視：www.sigmaaldrich.cn

操作流程

樣品制備

1A. 組織：

在Polytron®或其他合适的均質器中，在TRI Reagent（每50-100mg組織1ml）中均質化組織樣品。

注意：如果需要最小量的DNA剪切，請使用松散型均質器，而不是Polytron（參見DNA分離，步驟3，注釋b）。組織的體積不應超過TRI Reagent體積的10％。

1B.單層細胞：

直接在培養皿上裂解細胞。每10 cm2玻璃培養闆表面積使用1 ml TRI Reagent。加入試劑後，應使用移液管抽吸細胞裂解液數次，以形成均質裂解物。

注意：TRI Reagent與塑膠培養闆不相容。

1C.懸浮細胞：

通過離心分離細胞，然後通過重複移液使其在TRI Reagent中裂解。1 ml試劑足以裂解5–10 × 106個動物、植物或酵母細胞或5–10 × 106個細菌細胞。

注意：

• 如果樣品的脂肪、蛋白質、多糖或細胞外物質含量高，例如肌肉、脂肪組織和植物的塊莖部分，則可能需要 額外的步驟。均質化後，将勻漿12,000 × g、2-8℃離心10分鐘以除去不溶物質（細胞外膜、多糖和高分子量 DNA）。上清液含有RNA和蛋白質。如果樣品脂肪含量高，則應該除去水相表面上的一層脂肪物質。将澄清的上清液轉移到新管中并繼續進行步驟2。按照DNA分離步驟2和3從沉澱中回收高分子量DNA。
• 一些酵母和細菌細胞可能需要均化器。
• 将細胞在TRI Reagen中均質化或裂解後，可将樣品在-70℃下儲存長達1個月。

相分離：為確定核蛋白複合物完全解離，使樣品在室溫下靜置5分鐘。每ml TRI Reagent加入0.1ml 1溴-3氯丙烷或0.2ml氯仿（參見相分離，注釋a和b）。緊緊蓋住樣品，劇烈搖動15秒，并在室溫下靜置2-15分鐘。将所得混合物以12,000 × g、2-8℃離心15分鐘。離心将混合物分成3個相：紅色有機相（含有蛋白質），中間相（含有DNA）和無色上層水相（含有RNA）。

注意：

• 1-溴-3-氯丙烷的毒性低于氯仿，用它進行相分離降低了DNA污染RNA的可能性。4
• 用于相分離的氯仿不得含有異戊醇或其他添加劑。
• 關于從水相中分離Poly A+組分的資訊，請參見附錄I。

RNA分離或提取

1.将水相上清液轉移到新管中，每ml用于制備步驟1中的TRI Reagent加入0.5ml 2-丙醇，混合。讓樣品在室溫下靜置5-10分鐘。在2-8℃下以12,000 × g離心10分鐘。RNA沉澱在管的側面和底部。

注意：将中間相和有機相儲存在2-8°C，以備用于随後的DNA和蛋白質分離。

2.去除上清液，在每1ml用于樣品制備步驟1的TRI Reagent中至少加入1ml 75％乙醇來洗滌RNA沉澱。渦旋樣品，然後在2-8°C下以7,500 × g離心5分鐘。

注意：

• 如果RNA顆粒漂浮，則以12,000 × g在75％乙醇中洗滌。
• 樣品可以在2-8°C下在乙醇中儲存至少1周，在-20°C下儲存長達1年。

3.通過風幹或真空将RNA沉澱短暫幹燥5-10分鐘。不要讓RNA沉澱完全幹燥，否則會大大降低其溶解度。請勿在真空（Speed-Vac®）下離心幹燥RNA沉澱。向RNA沉澱中加入适量的甲酰胺、水或0.5％ SDS溶液。為了促進溶解，用微量移液管在55-60℃下反複吹打10-15分鐘以混合。

注意：

• RNA的最終制備液中不含DNA和蛋白質。它應該具有≥1.7的A260 / A280比率。
• 組織的典型産率（mg RNA/mg組織）：肝髒、脾髒：6-10mg；腎髒：3-4mg；骨骼肌、腦：1-1.5mg；胎 盤：1-4 mg。
• 培養細胞的典型産率（mg RNA/10⁶細胞）：上皮細胞：8-15mg；成纖維細胞：5-7mg。
• 瓊脂糖凝膠中RNA的溴化乙錠染色顯示兩條主要條帶：小（2 kb）和大（5 kb）核糖體RNA，低分子量 (0.1–0.3 kb) RNA，以及高分子量（7-15 kb）RNA的離散條帶。

DNA分離或提取

1.小心地去除與中間相重疊的水相并丢棄。為了從中間相和有機相中沉澱DNA，在每1ml用于樣品制備步驟1的TRI Reagent中加入0.3ml 100％乙醇。倒置混合并在室溫下靜置2-3分鐘。在2-8℃下 2,000 × g離心5分鐘。

注意：在DNA沉澱之前去除剩餘的水相是保證分離DNA品質的關鍵步驟。

2.去除上清液，儲存在2-8°C，以備進行蛋白質分離。用0.1M檸檬酸三鈉、10％乙醇溶液洗滌DNA沉澱兩次。對每1ml用于樣品制備步驟1的TRI Reagent使用1ml洗滌溶液。在每次洗滌期間，使DNA沉澱靜置（偶爾混合）至少30分鐘。在2-8℃下以2,000 × g離心5分鐘。将DNA沉澱重懸于75％乙醇（每ml TRI Reagent1.5-2ml）中，并在室溫下靜置10-20分鐘。

注意：

• 重要提示：請勿縮短樣品處于洗滌液中的時間。30分鐘絕對是從DNA中有效去除苯酚所需的最短時間。
• 如果沉澱團有> 200mg DNA或大量非DNA材料，則需要在0.1M檸檬酸三鈉、10％乙醇溶液中額外洗滌。
• 懸浮在75％乙醇中的樣品可以在2-8℃下儲存數月。

3.在真空下将DNA沉澱幹燥5-10分鐘，并溶解于8mM NaOH中，用微量移液管反複緩慢移液混合。加入足量8mM NaOH，使最終DNA濃度為0.2-0.3mg / mL（對于從50-70mg組織或10⁷個細胞中分離的DNA，通常為0.3-0.6ml）。這種溫和的堿性溶液可確定DNA沉澱完全溶解。以12,000 × g離心10分鐘，以除去任何不溶物質，并将上清液轉移到新管中。

注意：

• 粘性上清液表明存在高分子量DNA。
• DNA的大小取決于均質化過程中施加的力。避免使用Polytron均質器。
• 溶解在8mM NaOH中的樣品可以在2-8℃下儲存過夜。如要長期儲存，則将pH值調節至7至8之間，并補 EDTA（最終濃度1 mM）。
• 要确定DNA濃度，取一份等分試樣，用水稀釋，并測量A260。對于雙鍊DNA，1 A260機關/ml =50μg/ml
• 為了計算細胞數，假設人、大鼠和小鼠的10<sup>6</sup個二倍體細胞的DNA量分别等于7.1μg、6.5μg和5.8μg。
• 組織的典型産率（μg DNA/mg組織）：肝髒、腎髒：3-4μg；骨骼肌、大腦和胎盤：2-3μg。
• 培養的人、大鼠和小鼠細胞的典型産率：5-7μg DNA/106細胞。

用PCR擴增DNA

溶于8mM NaOH後，用HEPES調節至pH 8.4（加入86μL 0.1M HEPES 遊離酸/ml DNA溶液）。将樣品（通常0.1-1μg）加入PCR混合物中，并執行PCR實驗方案。

用限制酶消化DNA

用HEPES将DNA溶液的pH調節至限制酶消化所需的pH，或者針對1mM EDTA、pH 7-8透析樣品。在最佳條件下使限制酶消化繼續3-24小時。建議每1μg DNA使用3-5機關的酶。通常，80-90％的DNA被消化。

蛋白質分離

1.每1ml用于樣品制備步驟1的TRI Reagent，用1.5ml 2-丙醇，從苯酚-乙醇上清液（DNA分離，步驟2）沉澱蛋白質（參見注釋）。使樣品在室溫下靜默至少10分鐘。在2-8℃下以12,000 × g離心10分鐘。

注意：對于某些樣品，蛋白質沉澱可能難以溶解在1％ SDS（步驟3）中。使用下列步驟來解決這一問題：

• 在2-8℃下，更換3次0.1％ SDS，每次透析苯酚-乙醇上清液。
• 在2-8℃下以10,000 × g離心透析液10分鐘。
• 澄清的上清液含有适用于Western Blotting的蛋白質。

2.棄去上清液，并在0.3M鹽酸胍 / 95％乙醇溶液中洗滌沉澱團3次，每1ml用于樣品制備步驟1的TRI Reagent用2ml洗滌溶液。在每次洗滌期間，室溫下将樣品在洗滌溶液中儲存20分鐘。在2-8℃下以7,500 × g離心5分鐘。洗滌3次後，加入2ml 100％乙醇，并渦旋蛋白質沉澱。在室溫下靜置20分鐘。在2-8℃下以7,500 × g離心5分鐘。

注意：懸浮在0.3 M鹽酸胍 / 95％乙醇溶液或100％乙醇中的蛋白質樣品可在2-8°C下儲存1個月或在-20°C下儲存1年。

3.在真空下幹燥蛋白質沉澱5-10分鐘。将沉澱團溶解在1％ SDS中，将微量移液管吸頭置于溶液中，移動柱塞幫助溶解。在2-8℃下以10,000 × g離心10分鐘，以除去任何不溶物質。将上清液轉移到新管中。蛋白質溶液應立即用于Western blotting或儲存在-20°C下。