2021年12月6日，克利夫蘭醫學中心Lerner研究所方堅松博士（第一作者，現廣州中醫藥大學副研究員）等聯合在Nature 子刊Nature Aging上線上發表了題為“Endophenotype-based in silico network medicine discovery combined with insurance record data mining identifies sildenafil as a candidate drug for Alzheimer’s disease”的研究論文。該研究報道了一種基于内表型網絡方法的AD藥物重定位政策，結合對包含723 萬人的保險記錄資料庫進行回顧性隊列分析，發現了老藥西地那非（sildenafil）與AD發病風險的降低顯著相關(風險比 (HR)= 0.31, 95% 置信區間(CI) 0.25–0.39, P< 1× 10的-8次方)。進一步傾向性評分分層分析發現，西地那非與其它幾種藥物（地爾硫卓、格列美脲、氯沙坦和二甲雙胍）相比，同樣可顯著降低AD發病風險。研究還發現，在AD病人來源的多功能幹細胞分化的神經元模型中，西地那非可顯著增加神經突生長并降低磷酸化Tau蛋白表達，從機制上進一步支援了其對 AD 的潛在應用價值。總之，該研究證明了内表型網絡結合臨床電子病曆挖掘可作為一種有效促進AD藥物開發的政策，同時可應用于其它神經退行性疾病的藥物發現。
1.研究背景
阿爾茨海默症（Alzheimer's disease, AD），俗稱“老年癡呆症”， 是一種嚴重的神經退行性疾病，主要臨床特征表現為記憶力減退、思維遲緩以及性格和行為的改變。目前，全球約有5000萬AD患者，且随着全球老年化的加劇，其患病率也在不斷上升，預計到2050年，阿爾茲海默症患者将增加至1.5億以上。令人遺憾的是，AD的病因複雜，科學界至今仍未破譯阿爾茲海默症發病的具體機制，至今也仍未有真正逆轉AD程序的藥物上市。近十年來，随着藥物重定位在新藥研發中迸發出了巨大潛力，科學家們開始關注于通過老藥新藥途徑開發抗AD藥物, 據統計目前已有近30多個FDA已上市的藥物正在做AD相關的臨床試驗。
AD發病機制複雜，主流觀點認為病因是β-澱粉樣蛋白（Aβ）和Tau蛋白沉積造成的神經元大量死亡。即Aβ形成斑塊，tau蛋白形成神經纖維纏結，共同危害神經元健康。然而，數十年來靶向這兩個靶點的AD藥物臨床試驗卻鮮有成功。目前越來越多的臨床與實驗表明，AD的誘發主要來自于Aβ和tau的互相作用，而非單純Aβ或tau引起，即Aβ和tau存在協同作用（Nat Neurosci. 2020;23:1183-93; Alzheimers Dement. 2017;13, 644–53；Cell Rep. 2019;29, 3592–604）。内表型網絡是一類能夠表征某一獨立生物體系功能中間遺傳特征的分子網絡，可進一步發展為多種遺傳學相關的疾病。此前方堅松博士等受邀藥學頂級期刊 Medicinal Research Reviews 雜志（第一作者），發表了題為“Harnessing endophenotypes and network medicine for Alzheimer's drug repurposing”的前沿綜述，提出了基于網絡醫學架構的AD内表型網絡假說（Med Res Rev. 2020 ;40(6):2386-2426）。該假說認為複雜性疾病AD涉及多種病理機制，每一種病理機制可以抽象為一種内表型（Endophenotype），而這些表型可以同時參與多種疾病的發病機制。
在此篇Nature Aging研究中，作者們旨在運用先前提出的内表型網絡方法開展抗AD的藥物重定位研究，并結合大規模的臨床電子病曆資料挖掘評估候選藥物與AD疾病風險之間的關聯性，同時結合體外AD細胞模型研究其作用機理（圖1）。
圖1 基于内表型網絡方法的抗AD藥物重定位政策
2.主要發現
研究團隊首先通過整合144個高品質的AD種子基因用于建構Aβ與Tau互作内表型網絡（圖2），并使用最大連接配接子圖LCC方法證明該網絡具有顯著的子產品特征。接着證明了與單獨靶向Aβ與Tau的藥物相比，同時靶向Aβ與Tau蛋白的AD在研藥物與多組學來源的AD疾病模型具有更為顯著的AD網絡近鄰特征，即表現出與AD更好的病理相關性。基于此他們建構并論證了Aβ與Tau互作内表型網絡能夠很好的拟合AD的病理特征，并采用該網絡模型預測了美國FDA的1608個已上市藥物，發現了66個潛在的抗AD藥物。
圖2 Aβ與Tau互作内表型網絡
進一步的分析發現老藥西地那非為最優的候選藥物，已報道的文獻證據表明了西地那非能夠顯著改善多個AD轉基因動物模型（APP/PS1和J20）小鼠的學習記憶能力（Br. J.Pharmacol. 2011; 164, 2029–2041; Neuropharmacology. 2013; 64, 114–123），同時也有兩項小規模臨床試驗初步顯示西地那非可能對治療 AD 具有潛在益處（J. Alzheimers Dis. 2019;70, 163–170；J. Alzheimers Dis. 2017;60, 1351–1364）。然而，目前未見大規模回顧性隊列研究顯示其與降低AD風險相關。
基于此，該團隊利用MarketScan Medicare Claims資料庫中2012 年至 2017 年的保險記錄資料（包含732萬人的臨床電子資訊）系統研究了西地那非服用人群與AD發病風險之間的關系。為了盡量降低混雜因素，共進行了三類基于藥物隊列的觀察性研究：1) 西地那非服用者 vs.非西地那非服用者，2) 西地那非 vs.對照藥物（地爾硫卓或格列美脲，未見AD相關的臨床證據），以及 3) 西地那非與對照藥物（氯沙坦或二甲雙胍，已開展過抗AD臨床試驗）。對于每個隊列比較，首先對資料進行了傾向評分分層（n = 10），并完成了分層前後的 Kaplan-Meier 曲線及其對數秩檢驗，以及 Cox 回歸分析。結果表明，這五個藥物流行病學分析揭示了服用西地那非對降低 AD 風險具有顯著益處。緊接着，進一步地考慮疾病（常見并發症冠心病、高血壓及二型糖尿病）因素、性别因素及年齡因素校正後，進一步揭示了服用西地那非對降低男性患AD風險顯著相關。盡管如此，未來仍需要進一步設計随機對照臨床試驗去證明西地那非與AD之間的因果關系。
為了進一步研究西地那非抗AD的分子機制，研究團隊利用網絡分析預測出西地那非抗AD的作用機制與影響Tau功能相關的蛋白（GSK3β與CDK5）有關，并在脂多糖刺激的人源小膠質細胞HMC3細胞模型上進行驗證，發現了西地那非（30 和 100 μM）預處理能夠降低GSK3β和 CDK5的磷酸化水準。同時在AD病人來源的多功能幹細胞分化的神經元模型中，西地那非可顯著減少了 分化的神經元中 p-tau 181 的積累。
3.總結
本研究提供了一種基于網絡的藥物重定位綜合方法，該方法結合了内表型網絡發現、大規模AD患者資料分析，以及體外分子機制探讨，發現了具有降低AD發病風險的抗AD有效候選藥物西地那非。該方法同樣可用于研究用其它AD相關的内表型，如發炎和代謝功能障礙，同時也适用于其它神經退行性疾病。該研究還發現了除老藥西地那非以外的其它衆多潛在抗AD藥物，未來将開展更多的臨床前或臨床研究去進一步發現它們的潛在應用價值。