景傑生物 | 報道
組蛋白翻譯後修飾，被認為構成一類超越基因序列的“組蛋白密碼”，控制着遺傳資訊的組織層次及其在染色質層面的解讀。組蛋白賴氨酸乙酰化是研究最早的一類組蛋白修飾，與基因活化關系密切。除了組蛋白乙酰化外，近年來，丙酰化、丁酰化 [1]等多種新型酰化修飾被相繼報道，絕大多數新型酰化修飾發生在已知的乙酰化的位點上。這一系列研究極大地豐富了對組蛋白密碼、表觀遺傳學和翻譯後修飾領域研究的認識。
組蛋白乙酰化調控一個重要工作模型就是組蛋白乙酰化可以被特定閱讀器結構域所識别，進而招募染色質調控因子到特定區域，協同完成基因表達調控。這種識别是調節蛋白群組蛋白的結合以及染色質結構重塑的先決條件。比較為人熟知的賴氨酸乙酰化閱讀器是溴域（Bromodomain, BRD），目前數個溴域靶向的一類新藥已處于臨床試驗階段。BRD4是BET溴結構域家族的成員，已被确定為許多癌症的治療靶點，包括急性淋巴細胞白血病（ALL）、多發性骨髓瘤、結腸癌和乳腺癌等 [2] [3]。
2021年7月27日，來自上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院的糜堅青研究員等合作團隊，在Cell Reports上發表了題為“Metabolically controlled histone H4K5 acylation/acetylation ratio drives BRD4 genomic distribution”的研究成果。研究證明了線粒體活性和β-氧化影響組蛋白H4K5酰化修飾/乙酰化的比率，進而調控BET家族成員BRD4與染色質的互作。表明代謝驅動的組蛋白乙酰化/酰化比率調節，可能是調節溴域因子功能及基因組分布的共同機制。
景傑生物作為共同作者參與了該研究，且為該研究提供了一系列的高特異性蛋白修飾抗體，如抗H4K5bu（PTM-313/-310）、抗H4K8bu（PTM-311）、抗H4K5cr（PTM-521）、抗H4K8cr（PTM-522）、抗H4K5ac（PTM-119）、抗H4K8ac（PTM-120）、抗H4K5bhb（PTM-1205）和抗H4K5ac（PTM-1407）。
Graphical abstract
01FASTKD1控制線粒體活性
研究團隊前期研究發現，FASTKD1（Fas activated serine/threonine kinase domain 1）在急性淋巴細胞白血病 (ALL) 中異位表達，且定位于線粒體上，是以可能線上粒體中發揮功能。是以研究人員首先在急性淋巴細胞白血病（ALL）細胞系中建構了FASTKD1的穩定敲降/除細胞系，結果顯示，FASTKD1的缺失會導緻線粒體相關基因的表達顯著上調（圖1A）。此外，qPCR結果顯示線粒體相關基因如ND2和DN3在FASTKD1缺失後會被顯著激活，且這一現象在重新過表達FASTKD1後消失（圖1B）。這表明FASTKD1能調節線粒體活性，下調線粒體相關基因的表達。
圖1、FASTKD1控制線粒體活性
02線粒體活性影響H4K5酰化/乙酰化修飾比率
接着，研究人員運用Label-Free 蛋白質組定量技術，對野生型REH和FASTKD1 KO細胞的組蛋白進行了鑒定。結果顯示，H4K5/ K8位點丁酰化對FASTKD1的缺失最為敏感（圖2A）。WB結果顯示FASTKD1 KO細胞系中H4K5/ K8的丁酰化和巴豆酰化修飾水準明顯增加，而乙酰化修飾水準并未改變（圖2B）。抑制細胞線粒體活性顯著抑制組蛋白H4K5丁酰化和H4K5巴豆酰化在FASTKD1 KO細胞中的激活現象（圖2C），這表明線粒體活性參與調控H4K5酰化/乙酰化修飾水準的動态變化。
圖2、FASTKD1基因失活、線粒體激活導緻H4K5K8酰化增加
03脂肪酸合成/β-氧化是組蛋白酰化的主要驅動因素
脂肪酸合成和β-氧化涉及酰基輔酶A衍生物的産生，是以有可能促進組蛋白酰化發生。研究人員使用酰基輔酶a合成酶的競争性抑制劑Triascin C、和乙酰輔酶A羧化酶(ACC1) 抑制劑ND-630來阻止脂肪酸的合成，并監測對H4K5K8乙酰化和丁酰化的影響。結果顯示，FASTKD1 KO細胞中在Triascin C或ND-630處理後，H4K5丁酰化的增加現象消失，但乙酰化未受影響（圖3D和E）。促進和抑制β-氧化實驗結果顯示，脂肪酸氧化小分子octanoate的處理增加了細胞中H4K5丁酰化的水準，而消除了FASTKD1 KO細胞中H4K5丁酰化的增加（圖3F、G）。這表明脂肪酸合成和β-氧化是組蛋白發生酰化修飾的主要驅動因素。
圖3、脂肪酸合成/β-氧化是組蛋白酰化的主要驅動因素
04 H4K5酰化/乙酰化修飾動态調節BRD4-染色質互相作用
前期研究發現，在精子發生的晚期階段，含有H4K5丁酰化的核小體會逃避乙酰化修飾，其組蛋白上Brdt（bromodomain testis-specific）也随之減少。由此，研究人員猜測H4K5乙酰化/丁酰化-巴豆酰化修飾比率的變化也可能影響BRD4和染色質之間的互相作用。pull down實驗證明，當H4K5發生丁酰化修飾時，BRD4無法結合H4（圖4A），表明H4K5丁酰化會影響BRD4與染色質互相作用的能力。
圖4、H4K5酰化/乙酰化修飾動态調節BRD4-染色質互相作用
05 H4K5酰化/乙酰化修飾動态調控BRD4定位分布及功能
研究人員通過 ChIP實驗，來觀察各細胞系中H4K5cr和H4K5bu與H4K5ac之間的關系。結果發現，随着H4K5ac修飾水準的增加，H4K5cr-bu/H4K5ac比例也進一步升高（圖5A）。這說明H4K5酰化的增加優先發生在高度乙酰化的染色質區域。抗BRD4 ChIP-seq實驗結果顯示，BRD4在高活性基因的TSS（transcriptional start site）上積累，且在FASTKD1 KO細胞中更為明顯（圖5B）。這說明H4K5cr-bu/ac比率的變化促進了BRD4遷移，改變了BRD4的定位分布。
圖5、H4K5酰化/乙酰化修飾動态調控BRD4定位分布及功能
本研究揭示了在染色質上組蛋白乙酰化和其他酰化的系統共存現象。同時發現，線粒體活性增強會促使組蛋白H4K5酰化/乙酰化修飾比率整體增加，進而導緻溴域因子BRD4與乙酰化核小體的結合減弱，BRD4可以被重新配置設定到特定和局部的基因組區域，包括在活性基因的TSS位點上。由此表明，線粒體代謝驅動的組蛋白乙酰化/酰化比率可能是調節溴域因子功能及基因組分布的常見機制。
參考文獻：
[1] Chen, Y, et al., 2007, Lysine propionylation and butyrylation are novel post-translational modifications in histones. Mol Cell Proteomics.
[2] Flynn, et al., 2015, A Subset of Human Bromodomains Recognizes Butyryllysine and Crotonyllysine Histone Peptide Modifications. Structure.
[3] Olp, M.D, et al.,2017, Metabolically Derived Lysine Acylations and Neighboring Modifications Tune the Binding of the BET Bromodomains to Histone H4. Biochemistry.
[4] [1] Gao M , et al., 2021, Metabolically controlled histone H4K5 acylation/acetylation ratio drives BRD4 genomic distribution. Cell Reports.