今天推送的文章是发表在comput struct biotechnol j.上的“can constraint network analysis guide the identification phase of knowvolution? a case study on improved thermostability of an endo-b-glucanase”，通讯作者是德国亚琛工业大学生物技术研究所的 ulrich schwaneberg等人。
内切葡聚糖酶是一种广泛用于食品和饲料、生物燃料、洗涤剂以及纸浆和造纸等行业的酶。目前，青霉菌产生的纤维素酶因其高活性而被认为是降解纤维素的很有前途的生物催化剂。内切葡聚糖酶ii(pvcel5a)是从疣状青霉中分离出来的一种内切β-1，4-葡聚糖酶，活性高，是该菌的主要内切葡聚糖酶。它属于糖基水解酶家族5(gh5)。来自gh5的纤维素酶具有（β/α）8结构，其核心为8个β折叠，外层为8个α螺旋。
在工业化工生产中，热稳定性通常是酶工艺稳定性的先决条件。目前的问题是，高活性和高耐热性往往是相互矛盾的特性，为了保持酶作为一种有竞争力的催化选择，它们必须具有较高的热稳定性，并在较宽的温度范围内保持较高的活性。结合实验和计算的蛋白质工程策略正在出现，以减少实验筛选工作并加快酶工程运动。约束网络分析(cna)是一种很有前途的计算方法，它可以识别酶中的有益位置来提高热稳定性。将cna应用于生物分子，旨在识别它们的刚性簇和柔性区域的组成，这有助于理解生物分子结构、稳定性和功能。在cna中，生物分子被建模为约束网络，其中共价和非共价相互作用组成边缘，原子代表节点。为了监测生物分子的刚性和柔性的层次结构，cna通过按其强度的递增顺序从网络中连续移除非共价约束来执行热展开模拟。
在本研究中，作者以cel5a为例，通过比较通过随机突变(定向进化)和基于cna的变异预测(合理设计)识别有益位置来评估cna推进knowvolution第一阶段的潜力，以提高其热稳定性。通过比较两种策略在改善热稳定性方面的实验效果和成功情况，评估了这两种策略识别有益部位的性能。
本工作利用ep-pcr技术构建了随机诱变的eglii（来自疣状青霉的内切β-葡聚糖酶基因eglⅡ）文库。生成的文库在琼脂平板实验中进行预筛选，随后通过将活性克隆转移到液体培养中来丰富文库，并利用优化的azo-cmc筛选热稳定性提高的文库。在琼脂平板实验中，对约8000个克隆的文库进行了预筛选，其活性/失活比为0.23。用1890个活性克隆构建了一个丰富的文库，并对其进行了热稳定性筛选。从富集的文库中，22个克隆的热稳定性比eglii野生型提高了3.1倍，测序后，发现了15个变异体和20个不同的替换(图2)。已鉴定的变异体携带单、双和三重替换。总共鉴定了18个不同的位置，但由于它们构成了双重或三重变体，很难确定地区分中性、提高或降低eglii热稳定性的替代。因此仅凭借以上信息不能确定是否所有这些位置都影响酶的热稳定性，也无法确定所发现的取代位是否代表了提高热稳定性的最佳氨基酸。这18个位置占eglii氨基酸总量的5.7%(314个氨基酸中有18个位置)。在变异水平上，ep-pcr文库中热稳定性提高的克隆得率为0.27%(8000个克隆中有22个)。
图2（b为从ep-pcr文库获得的eglii野生型中取代位置(黄色部分)的表示）
为了识别eglii上的结构弱点，采用cna对md模拟生成的野生型eglii结构系综进行了热展开模拟。通过目测展开的轨迹，发现了四个主要的相变，t1-t4(图3a)。
图3（c为野生型eglii(黄色球体)预测弱点的定位）
在展开过程中，首先是αa螺旋，其次是αd螺旋和αg-i螺旋，then αc螺旋和αf螺旋，最后是αe螺旋，依次在326,338,342和344k从最大的刚性团簇中分离出来。eglii的刚性区域和柔性区域的层次结构显示，大多数螺旋在t2从最大的刚性簇中分离出来，其次是t3。由于大多数位于c末端的螺旋在t2和t3与最大的刚性团簇分离，考虑到那里的取代可以提高与最大刚性团簇的相互作用强度，从而随着温度的升高延缓该团簇的解体，这一区域在提高热稳定性方面特别有希望。
接下来，薄弱点被确定为这些螺旋的边缘残留物。作者遵循了这样的假设，即螺旋边缘的结构越稳定，这些区域的结构就会变得越稳定。因此，如果边缘残基是以取代为目标的，稳定蛋白质的可能性应该很高。此外，还计算了rcij and rcij,neighbor，以监测eglii野生型在每个残基水平上的局部刚性(图3b)。这两个指数都支持上述观察结果。总共预测了25个薄弱点，即占所有314个eglii残基的8%(图3c，表1)。
表1
在cna鉴定之后，分析了所选弱点的进化保守性，以进一步减少实验工作量。较高的保守性分数是蛋白质中某一位置功能或结构重要性的指标。因此，实验分析排除了保守性得分≥8的弱点。这导致了18个薄弱点(d76、t77、g92、k93、s114、f129、k130、l134、n189、t190、v222、s240、l244、s256、s273、n299、s308、t312)的选择，这使得替代工作仅集中在~6%的蛋白质残留物。
通过ssm（定点饱和突变）对选定的18个弱点进行饱和，系统地探讨这些弱点对eglii热稳定性的影响。对于每个选定的弱点，设计引物，进行位点饱和反应，分别转化进毕赤酵母。每个ssm文库共180个克隆，共筛选出3240个克隆(18个位点，每个位点180个克隆)，每个位点可替换的克隆数约为98%。与预筛选~8 000个ep-pcr文库相比，实验工作量减少了~40%。对于预测薄弱点的替换，发现6个替换(t312r、t77v、t77e、l244r、v222p和s308p)可以提高热稳定性。
表2
在75℃、eglii野生型最适温度和30℃下测定了已鉴定的热稳定性提高的突变体(t312r、t77v、t77e、l244r、v222p和s308p)的比活力，结果表明，eglii野生型在75℃和30℃时的比活力分别为249±38u mg 1u和58±4u mg 1u。值得注意的是，从cna策略获得的所有6个变异体在75℃时保持了超过90%的eglii野生型比活力，在30℃时保持了100%。cna策略能够识别具有更好的热稳定性和在较低温度下保持活性的变体。
关于eglii变异体热稳定性增强的结构基础，在t312r和l244r中，在邻近的二级结构单元上可以形成盐桥，这在eglii野生型中是不存在的。在大多数情况下，盐桥被认为可以增强热稳定性(图3)。至于其他取代基，有利的焓贡献似乎不太可能是热稳定性的决定因素。77位暴露在溶剂中，因此不可能与邻近残基直接相互作用(图3)。在嗜热蛋白质中，蛋白质表面的谷氨酸残基可以通过增加极性表面积来稳定暴露的结构，这可以解释取代t77e的稳定性。取代t77v可能会使螺旋的n端部分稳定下来，因为与苏氨酸相比，缬氨酸的螺旋倾向更有利。位置222和308包括脯氨酸的取代，其在确定局部构象方面具有独特的作用，该局部构象可能导致熵驱动的热稳定。
在变异体水平上，筛选出的3240个克隆获得了0.18%(6个/3240个)的热稳定性增强的变异体。根据eglii活性中每个选择的弱点的影响，通过在琼脂平板中预先筛选每个位置>180个克隆，并仅用满足>98%覆盖率所需的必要克隆进行富集，可以进一步减少筛选工作。在知识进化活动中，主要的筛选负荷来自第一阶段和第二阶段，并包括数千个克隆的文库。因此，cna方法可以有益地用于提高热稳定性的知识进化运动的第一阶段(鉴定)，从而进一步减少筛查工作。
注意，通过cna方法的设计，识别结构弱点的目的是提高热力学热稳定性，而导致不可逆变性的动力学参数则无法进行cna分析。最后，与随机突变文库相比，从cna分析中产生的ssm文库具有几个优点。首先，可以确定提高eglii热稳定性的位置。其次，可以确定哪种氨基酸代表一个位置的最佳替代。第三，对于每个改进的变体，可以定量地确定每个位置的影响。
整理：李岚雪
文章信息：
pmcid: pmc7822948
pmid: 33552446
doi: 10.1016/j.csbj.2020.12.034