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Pelteobagrus fulvidraco Richardson是一种在中国主要淡水水域分布较广、经济价值较高的小鱼，因其肉质细腻、口感鲜美、肌间刺少而深受消费者欢迎。近年来，在江苏、浙江、广东和四川省部分地区，人工养殖黄疸的规模和集约化程度不断提高，一些农民由于成功饲养黄疸，获得了较好的经济效益。随着鲱鱼养殖规模的迅速扩大，集约化程度大大增加，各种疾病对黄疸的危害越来越严重，其中细菌性疾病是黄疸养殖中较为严重的一种疾病。国内报道的黄疸细菌性疾病主要属于气单胞菌属（Aeromonas）部分的物种，如气体单核细胞杆菌点属（Aeromonas subsupportata），可引起黄疸腐烂、肠炎、印刷病、出血性水肿等症状。
自2012年5月以来，我们在江苏省盐城市和浙江省灵湖区开展了圈养喂养期间黄鲱鱼"裂头病"病原菌的初步研究。从具有典型病症的患病池塘收集黄疸，将细菌与腹水，肝脏，肾脏等分离，导致培养基中高度一致的菌落，其健康黄疸人工感染的结果证实，分离的菌株是导致黄疸"开裂头病"的病原体。采用经典生理生化指标测量和16SrDNA均质性及系统发育分析，确定引起黄疸"开裂性头病"的细菌为刺槐菌。研究结果报告如下。
1 材料和方法
1.1 实验材料
2008年5月至10月，在江苏省盐城市和浙江省灵湖市部分养殖场的池塘中，出现了具有典型"干裂性脑袋病"症状的病态黄疸（图1）。这些病黄疸鱼长3.0~13.0厘米，健康黄疸鱼取自江苏省盐城市大丰水产养殖（盐城）有限公司黄疸鱼养殖池，体长约5.5±1.6厘米。
1.2 病原体分离
取典型的"开裂头病"黄疸病，用70.0%酒精进行体表消毒，在无菌条件下按照无菌操作的方法，分别从其肝脏、肾脏、鳃、溃烂的皮肤和腹水等病灶中取样，在BHI（Difco）琼脂平板中接种72小时后，挑出具有大致相同形态特征的优势菌落进行分离纯化3次， 转移到试管斜面介质中，并在低温下保存。
1.3 人工毒物攻击
选择健康，活泼，无伤害，平均体长（6.3±0.6）厘米的黄疸作为测试鱼。在1.0米×1.0米×每天0.5米的塑料水族箱中饲养30条黄疸尾，并喂食相当于每天鱼重2.0%的人工协调饲料（盐城裕达饲料有限公司生产黄疸鱼的特殊交配饲料）。驯化10d，测试黄鲱鱼是否适应环境，并确认无疾病症状，开始试验。试验期间，日均进料水量约50.0%，连续充氧并及时去污。设置4组实验组和2组对照组，每组30尾黄疸。使用从病黄疸鱼体内分离出并通过纯化培养的5种菌株，在BHI培养基中培养72小时后，用灭菌的生理盐水洗涤菌落并稀释至3.2×l07cfu / mL的浓度，作为毒液的备用。
有两种方法用于攻击活细菌的毒物，一种是注射方法来攻击毒物。即直接向黄疸尾部胸鳍基底注射细菌浓度为3.2×l07cfu/mL活菌液0.1mL，放入水族箱继续进食观察（图4）。将各菌株制备的菌液以2组平行组为注射试验组，将相同剂量的灭菌生理盐水注射到另一组黄疸中作为对照组的注射方法。
另一种是杀毒的沐浴方法，即先将玻璃烧杯中加入适量的活菌液，使水中细菌的浓度达到3.2×l05cfu/mL，然后将钢丝球划伤本体的黄鲱鱼放在玻璃烧杯中浸泡1.0h以上， 确保测试鱼可以完全接触病原体（图5）。浸泡鲱鱼后，将其放回塑料水族箱中，继续抬高和观察。
经过不同方法的活细菌毒害黄疸鱼在进食过程中观察15d，记录其症状和死亡人数，采取与自然条件相同的典型"爆裂头病"症状，从腹水、鳃、肝、溃烂的皮肤中进行病原体的重新分离和鉴定。
1.4 生理生化指标测定
病原体生理生化特性的测定及相关分类参照《一般细菌鉴定常用方法》（中国科学院北京微生物研究所，细菌分类组，1978年）和《伯杰细菌鉴定手册》（第9版）（Buchanan和Gibbons，1994年）。
1.5 16Sr DNA序列的同质分析及系统开发树的构建
1.5.1 模板DNA的制备
选取单个菌落悬浮在50.0 sL去离子水中，100.0 oC水浴加热5.0 min，4 oC条件下，以12，000 r/min的速度离心20 min，将上部清除为模板DNA。
1.5.2 PCR扩增
使用细菌16SrDNA广谱引物，向前27F：5' -AGAGTTTGATC（C / A）TGGCTCAG-3'（对应于大肠杆菌16SrDNA 8-27 bp位置），反向1492R：5' -TACGG（C / T）TACCTT GTTACGACTT- 3'（对应于E. COli 16S rDNA位置1492-1510 bp）进行PCR扩增。PCR反应体系（100μL）包含10.0 sl 10.0×PCR缓冲液（包括Mg2），2.0 sl l0.0 mmo/L 4 × × dNTP，5.0 sl10.0 smol/L正向和反向引物，1.0 sl Taq DNA聚合酶（5U），10.0 sl模板。PCR反应条件为：94°C变性4min，94°C天平30s，55°C退火30s，72°C延伸1min40s，30循环，72°C温度6min，PCR扩增产物由上海生物工程技术有限公司纯化和测序。
1.5.3 序列分析
将测量的菌株16Sr DNA序列输入GenBank数据库进行Blast比较，并与从GenBank数据库获得的类似序列一起，使用TheClustalx1.8软件执行多序列匹配安排以生成MEGA格式文件。使用 MEGA 3.0 软件，系统开发树是使用邻接连接构建的。通过 Bootstrapping（一种系统开发树置信度评估）对自展数据集进行了 1，000 次评估。
1.5.4 核酸序列
用于构建系统开发树的相关菌株及其在GenBank核苷酸序列数据库中的序列访问号如表1所示。
共 2 件
2.1 人工活菌发作后黄疸的症状及死亡状态
如表2所述，在他们被人工感染和以不同的方式隔离后，死亡人数和开始死亡的时间各不相同。
如表2所示，分离菌株的毒性强度与感染黄疸的死亡人数及其开始死亡的时间不同。注射后黄鲱鱼最早死亡时间为注射菌株后48h，浴发作死亡率相对较低，而注射攻击组死亡率较高，实验组死亡率高达100.0%。试验鱼死亡前的症状与自然条件下的病鱼相似，主要表现为体表和头部充血。对照组黄鲱鱼活动正常，未发生死亡。从病鱼的鳃、肝脏、肾脏、腹水和溃烂的皮肤等再次分离到受感染的细菌，检测结果符合科氏定律。
在实验条件下，有病症症状的病鱼吃得少，游得慢，经常独自游在水面或垂直悬浮在水面上，有不停旋转的症状 腹部等体表）出现不同程度的出血现象，腹部肿胀、腹水、肝塞或出血， 或者由于失血苍白，后期伴有背部、头部出血、皮肤溃烂，死亡率也很高。
2.2 致病菌的生理、生化特性鉴定
从典型的黄疸病腹水、肝、肾、鳃、溃烂的皮肤等部位被分离到优势菌株，菌落形式、大小、颜色在BHI琼脂平板上均一致：菌落圆、边缘整齐、灰白色、湿润。分析了5种菌株的生理生化特性，如表3所示。
表3所示结果可见于冰川观察和生理生化指标测定结果如革兰氏染色和鞭打染色，结果显示氧化酶阴性、精氨酸双水解酶阴性、尿素阴性、H2S阳性、产氡阳性、乳糖水解阴性蔗糖水解阴性、大鼠水解阴性、接触酶阳性、赖氨酸脱脂酶阴性、裂解液阴性、 明胶水解阴性、禽氨脱脂酶阴性、过氧化氢阴性、V.P试验阴性、甲基红试验阳性、丙烯二酸均采用阴性、七氯苷酸水解阴性、L-阿拉伯糖水解阴性、D-乙二醇用阳性、山梨糖醇水解阴性、麦芽糖水解阳性和葡萄糖发酵酸及气体生产;
2.3 16S rDNA序列系统的发育分析
HSY-12-02菌株的PCR结果和黄疸控制（中国微生物物种中心）从病态黄疸的肾脏获得（图6）。GenBank同源序列检索结果表明，HSY-12-02的l6S rDNA序列和爱德华属细菌的自然聚类与爱德华氏菌相同，后者与该细菌的同源性最高，为99.0%。在检索结果中，选取了9个参考菌株，从Genbank下载其l6S rDNA序列以构建系统开发树，系统开发树中同一物种的两个标准菌株最近相关并聚集成一个分支，实验菌株与暴虐的爱德华时代细菌自然聚集在一个分支中， 表明他们最亲近的亲属关系，所以我们最初将他们确定为Edwardsiella。
3 讨论
鉴别引起鱼病的致病菌的方法主要有三种，即传统的生理生化指标测定方法、自动鉴定系统鉴别方法和分子生物学鉴定方法（郭明元等，2006年）。这些方法各有其特点和缺点，传统的生理生化实验由于操作过程繁琐、耗时长，主观性比较大;最好还要有生化特征鉴定结果作为证据（范文辉等人，2005）。在利用生理生化指标确定菌株特性的基础上，通过分子生物学验证了这两种方法，得到的结果应该更准确。
根据已经做过的研究结果，细菌具有一种比较特殊的寄生状态，即当鱼进入谳食时，不是被细胞杀死，而是可以携带进入肝脏和肾脏的吞咽细胞的鼻窦，也会在吞噬细胞中增殖，从而破坏这些吞咽细胞。细菌的传播还可以感染鼻窦周围的内吞位细胞，并在这里形成微小的病变，然后逐渐扩大（Wakabayashi和Egusa，1972;若林和江古萨，1973年）。爱德华时代鱼类感染爱德华时代细菌的范围也非常广，与其他有爱德华时代细菌的鱼类相比，黄疸发生后最典型的症状是头部发红（这种症状类似于患病的斑点叉尾），腹部膨膨和大量血红色的腹部积水， 而体表出现出血斑点或血斑。
此外，爱德华时代的细菌可以感染蛇，蜥蜴，，短吻鳄和其他温暖的动物，如鸟类，臭鼬，猪，马，兔子和其他恒温动物，据信爱德华时代的细菌是蛇的正常肠道菌群的成员（ Sakazaki ， 1965 ）。
（作者：陈富昌、宋刚杰、孙立伟、吴强强、何登平、张佳琳、华中农业大学水学院、苏州通威特种饲料有限公司）
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