摘要： 20世纪90年代，该实验室从云南省哨兵动物采集的血液中分离出7种血清型蓝舌病毒（蓝舌病毒，BTV）。然而，这些菌株的遗传特征尚不清楚，从而阻碍了中国BTV进化的历史分析。为掌握云南省早期流行BTV菌株的遗传特征，对1995-1997年在云南省分离的25株BTV菌株的基因组片段2、3、7、7、10（Seg-2、-3、-7、-10）进行了一步法RT-PCR扩增、测序和序列分析。Seg-2序列分析表明，1995年至1997年，在云南省分离出7种不同的血清型（BTV-1、-2、-3、-4、-12、-15、-16）BTV菌株，属于A、B、G 6种基因型，BTV-12菌株的H、I和J、Seg-2属于西部区域类型，其余菌株的Seg-2属于东部地区，Seg-3和Seg-10序列分析显示，25个BTV菌株属于东部区域类型Seg-7序列分析表明，1个BTV-2，2个BTV-12和1个BTV-16菌株属于西部区域亚型，与南非和荷兰的Seg-7菌株有最接近的亲缘关系，其余的菌株是东部区域。以上结果表明，云南省存在多种血清型BTV流行，Seg-2和Seg-7基因重配菌株的发现表明，外来西部地区菌株已侵入云南省，并在传播过程中与中国菌株进行了基因重配。本研究为我国BTV的演化分析和溯源提供了数据参考。
蓝舌病（BT）是由蓝舌病毒（蓝舌病毒，BTV）感染引起的严重出血性动物疾病。BTV主要通过蜗牛属雌性昆虫的吸血叮咬传播，可感染牛、羊、骆驼、鹿等多种家养和野生反刍动物。绵羊的BTV感染可导致更高的发病率和死亡率。感染BTV的牛和山羊往往没有明显的临床症状，在BTV传播过程中起到了病毒储存的作用。BT被世界动物卫生组织（OIE）列为动物疾病的必要通知，因为它每年给全球畜牧业生产造成约30亿美元的经济损失。
BTV属于Reoviridae属orbivirus，其基因组由10个（基因组片段1至10，Seg-1至10）双链RNA（双链RNA，dsRNA）片段组成，可编码7个结构蛋白（VP1-7）和5个非结构蛋白（NS1-4和NS3a）。Seg-2 / VP2是BTV中突变最丰富的组件。VP2诱导受感染的动物产生特异性中和抗体，这对病毒血清型具有决定性作用。自2008年以来，全世界已经发现了四种新的BTV血清型（BTV-25-28）。结果，BTV血清型从24增加到28（BTV-1增加到28）。
虽然VP3序列在BTV菌株中高度保守，但编码该蛋白的Seg-3序列随BTV菌株的流行区域而异，因此世界上BTV菌株根据其序列差异可分为东西方两大地理类型（拓扑型）。与VP3类似，VP7和NS3蛋白也比较保守，编码片段中Seg-7和Seg-10的序列变异也与BTV菌株流行区密切相关，根据Seg-7和Seg-10的序列差异，世界上的BTV菌株分为东西两大区域类型， 以及几个区域亚型。Seg-3、-7和-10序列具有很强的地理特征，因此上述基因组片段序列分析可以为追踪病毒起源提供依据。
BT疫情于1979年首次记录于云南省石宗县的绵羊中。此后，BT暴发于湖北、安徽、四川、山西等省，并已分离为BTV-1、-2、-3、-4、-12、-15、-16株，其中BTV-1和BTV-16在中国广泛传播，可导致绵羊临床症状较为明显。自2012年以来，在国家公益产业（农业）的专项资助下，云南省畜牧兽医科学研究院在云南省、广西壮族自治区、广东省、湖北省、江苏省、山西省、新疆维吾尔自治区和内蒙古自治区等8个省设立了哨兵动物，共生产12种血清型BTV菌株（BTV-1， -2、 -3、 -4、 -5、 -7、 -9、 -12、 -15、 -16、 -21 和 -24）。
多种血清型BTV在中国普遍存在，不同血清型菌株之间缺乏交叉保护，病毒通过突变和基因重配，并不断产生突变菌株，这些都给当前的BT防控工作带来了挑战。对我国不同历史时期的BTV流行菌株进行序列比较分析，有助于掌握BTV的演化特点和BTV流行菌株的溯源性分析。虽然该实验室自2012年以来在中国完成了不同血清型BTV分离株的全基因组测序，但1995年至1997年云南省BTV流行菌株的遗传特征尚不清楚。为此，对1995年至1997年在云南省从7个血清型中分离出来的25个BTV菌株的Seg-2、-3、-7和-10基因片段进行了扩增、测序和遗传特征，以期为我国BTV的进化分析和溯源提供科学数据。
材料和方法
细胞、菌株和病毒培养
婴儿仓鼠肾细胞（婴儿仓鼠肾细胞，BHK-21），通过该实验保存;25株BTV毒株，从1995年至1997年在云南省始宗、芒市、景洪、庐山等地建立的哨兵牛中分离出来，病毒分离信息见表1。将分离出的BTV菌株接种BHK-21细胞，当细胞病变（细胞病变作用，CPE）达到90%刮掉细胞时，4°C 8000r/min离心15min，弃置沉淀，将病毒液分成，-80°C保存备用。
底漆设计与合成
根据GenBank上发表的BTV菌株序列，使用Oligo 7.0软件设计了10对引物，以扩增7种BTV血清型菌株中的Seg-2，-3，-7和-10（表2）。用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的水被稀释至10mol / L的终浓度备用。
RT-PCR 扩增和测序
从病毒基因组DNA / RNA提取试剂盒中提取病毒核酸，然后在94°C下变性至3min并立即冰浴。以5 μL变性核酸为模板，使用表2中的引物对，并使用一步法RT-PCR扩增BTV分离菌株的Seg-2，-3，-7和-10。采用通用DNA胶水回收纯化试剂盒，电泳胶回收PCR产物，用PCR扩增的上游和下游引物作为测序引物，对纯化的DNA进行双向测序。
序列分析和系统树构建
使用DNAstar软件（Ver 6.0），使用MEGA 6.0软件对测序结果进行序列拼接组装和序列比较分析。构建具有最大相似（最大相同，ML）的系统发生树：Seg-2序列选择"GTR-G"模型，Seg-3序列选择"TN93-G-I"模型，Seg-7序列选择"GTR-G-I"模型，Seg-10序列选择"T92加G"模型，自检（自举）值为1000。序列相似性，以平均值（平均值）表示。本研究中获得的序列由黑色钻石符号表示。系统树中从其他国家分离出的BTV菌株的序列由"GenBank系列number_BTV血清型，分离的国家，病毒隔离时间"表示。
结果和分析
用于Seg-2、-3、-7和-10的RT-PCR扩增
设计10对引物（表2）对由Seg-2，-3，-7和-10分离的25个BTV菌株进行一步RT-PCR扩增。结果表明，7对不同血清型的引物Seg-2能够特异性扩增大小约为1200bp的DNA片段，这与预期大小相对应，3对具有Seg-3，-7和-10的引物能够特异性扩增1100，1100和800bp的DNA片段， 分别对应于预期的大小。
Seg-2 序列分析
序列比较分析表明，1995-1997年在云南省分离的25个BTV菌株属于7个血清型，如BTV-1、-2、-3、-4、-12、-15和-16。全球27种血清型（BTV-1至27种）BTV菌株的Seg-2可分为12种基因型（核型A-L）。在系统发生树中，本研究中的25个BTV Seg-2菌株与相应的血清型BTV参考菌株聚类，属于A，B，H，I，G和J等6种基因型，相应的血清型BTV国际标准参考菌株的Seg-2序列相似性大于68.10%，VP2序列相似性大于75.00%（图1至2）， 通过血清中和和测试表明BTV血清型鉴定结果的正确性。在云南省分离出的同一血清型BTV的Seg-2/VP2序列高度相似，Seg-2核苷酸序列的相似度在92.80%~100%之间，VP2氨基酸序列的相似度在96.90%~100%之间（图2），表明云南省流行的同一血清BTV的Seg-2有近期的共同祖先。
研究发现，同一血清型BTV的Seg-2菌株在序列上也存在较大差异，并且根据这种差异，相同血清型BTV的Seg-2可分为东部拓扑型和西部拓扑型。系统发生树显示，云南省分离的两株BTV-12株（B139和B334）与南非的BTV-12株成簇，序列相似度大于98.10%，属于西部区域类型。云南省BTV-1、-2、-3、-4、-15和-16分离的血清型菌株Seg-2与东部相同血清型菌株聚集，Seg-2序列相似度为89.0 3%~95.46%，VP2序列相似度在90.92%~98.30%之间，Seg-2序列与同一血清型西部区域菌株的相似性为68.00%~95.81% VP2序列的相似性介于75.28%和97.14%（图1至图2）。
赛格-3 序列分析
Seg-3序列比较分析表明，本研究中25株BTV菌株之间Seg-3核苷酸序列的相似度在79.35%~93.93%之间，VP3氨基酸序列的相似度在96.83%~99.95%之间（图2）。构建的Seg-3系统树显示，从云南省分离出来的25个BTV菌株，以及来自台湾、澳大利亚和印度的菌株，形成了东部区域类型（图3）。25个BTV与国外分离的东部区域、西部和新血清型（BTV-25-28）的Seg-3序列相似度在74.63%~89.29%之间，VP3序列的相似度在88.69%~99.12%之间（图2）。在东部区域类型中，来自云南省的4个独立的BTV-15菌株和一个澳大利亚BTV-15菌株形成相对独立的集群，形成远东拓扑型（图3），n个区域和西部区域之间的复活节Seg-3/ VP3序列相似性以及新血清型（BTV-25-28）菌株为75.18%至79.60%/介于88.20%至96.83%之间（图2）。这一方面表明，云南省和澳大利亚的BTV-15菌株Seg-3有着共同的起源，另一方面也表明基因段在进化上是独立的。
赛格-7 序列分析
云南省不同血清型BTV菌株Seg-7核苷酸序列的相似度在73.85%~94.36%之间，VP7氨基酸序列的相似度在85.96%~99.35%之间（图2）。Maan等人已经证明，BTV的Seg-7可以分为三个东方地形1至3和七个西方地形1至7。从云南省分离出来的21株BTV菌株中的Seg-7属于东部拓扑型1至3个区域亚型，与来自台湾、日本、印度和澳大利亚的Seg-7菌株有最接近的亲缘关系（图4）。值得注意的是，云南省有4个BTV Seg-7属于西部区域类型：云南省的BTV-2菌株（B238）和BTV-12菌株（B139和B334）属于We Thestern拓扑型1区域亚型，与南非菌株有最接近的亲缘关系，序列相似性大于98.60%，BTV-16（B034）菌株为西部拓扑型3区域亚型， 与荷兰菌株（GQ506478）和南非菌株（GQ506512）的序列相似度为95.60%（图4）。4个BTV菌株的Seg-7序列相似度在78.90%~100%之间，VP7序列相似度在94.60%~100%之间，复活节与云南省分离 区域菌株的Seg-7/VP7序列相似性分别为78.33%~79.07%/94.46%~95.74%（图2）。
赛格-10 序列分析
云南省分离的25株BTV菌株的Seg-10核苷酸序列相似度为86.61%~94.68%，NS3氨基酸序列相似度在95.00%~99.08%之间（图2）。BTV菌株Seg-10系统发生树显示，基因片段序列分为两个东部地形型1至2和3个西方地形型1至3亚型（图5）。从云南省分离出来的22株BTV菌株均为东部1型区域亚型，与来自台湾、日本、印度和澳大利亚的Seg-10有最密切的亲缘关系（图5）。云南省3个独立的BTV-15株（B105、B358和B359）分别形成东部拓扑型2区域亚型，Seg与其他区域亚型菌株-10/NS3的序列相似性在76.93%~85.81%/83.41%~97.26%之间（图2、5）。本研究东区拓扑1亚型、东方拓扑型2亚型和西部地区亚型25个BTV与其他菌株的Seg-10序列相似度在77.02%~91.37%之间，NS3序列的相似度在83.23%~97.55%之间（图2，图5）。
讨论
云南省复杂的地理环境和气候条件造就了该地区动物、植物和病毒的自然多样性。云南省地处中国边境地区，与越南、老挝和缅甸等国家接壤，畜牧业和畜产品贸易频繁，动物疫病跨境传播风险高。多种血清型BTV在云南省广受欢迎，表明该地区在中国BT防控中发挥着重要作用。过去，BTV被认为主要流行于南纬35度和北纬40度之间。然而，随着气候变暖、茧活动范围的扩大和昆虫媒介潜在传播的增加，BT有逐渐向寒冷的高海拔、高纬度地区扩散的趋势，对中国北方的牛羊养殖构成威胁。掌握1995-1997年云南省BTV流行株的遗传背景，可以为分析我国BTV的进化特征，开展病毒传播和溯源分析提供有价值的序列信息。
从1995年到1997年，该实验室在云南省分离出7种血清型BTV（BTV-1、-2、-3、-4、-12、-15和-16），自2012年以来一直在云南省的哨点动物中分离出11种血清型BTV（BTV-1、-2、-3、-4、-5、-9、-12、-15、-16、-21和-24），表明云南省流行的BTV血清型的多样性。云南省首次发现4种血清型BTV，BTV-5，-9，-21和-24，表明中国可能存在其他血清型BTV，因此对中国流行BTV多样性的监测仍然是一个长期的过程。病毒位于不同的生态环境、不同的压力选择下，病毒的遗传进化会呈现出特定的区域特征。研究发现，云南省流行的BTV菌株序列也表现出独特的区域特征：云南省流行的BTV-15菌株的Seg-3形成了独立于东西部区域菌株的进化分支，BTV-16菌株的Seg-2也形成了独立的进化分支，BTV-15菌株的Seg-10形成了独立的东方拓扑2区域亚型揭示了BTV在云南省流行的进化独特性。
入侵云南省后，西部区域BTV菌株在传播过程中与中国当地流行菌株进行了基因重配，BTV株的Seg-7片段可以在自然环境中相对自由地重新匹配。这表明BTV进化可能主要由基因重配驱动，使病毒更适合在当地生态系统中传播和生存。
通过分析1995-1997年云南省从7个血清型中分离出来的Seg-2、-3、-7和-10、25个BTV菌株的遗传特征，发现云南省血清型BTV流行多种多样，既有当地长期流行的BTV-1和BTV-16菌株，也有入侵云南省后的西部区域BTV菌株， 再匹配的应变，说明我国BT防控形势十分严峻。本研究为分析中国BTV菌株的突变和基因再现提供了第一手资料，为追踪中国BTV菌株的来源提供了依据。