摘要： 20世紀90年代，該實驗室從雲南省哨兵動物采集的血液中分離出7種血清型藍舌病毒（藍舌病毒，BTV）。然而，這些菌株的遺傳特征尚不清楚，進而阻礙了中國BTV進化的曆史分析。為掌握雲南省早期流行BTV菌株的遺傳特征，對1995-1997年在雲南省分離的25株BTV菌株的基因組片段2、3、7、7、10（Seg-2、-3、-7、-10）進行了一步法RT-PCR擴增、測序和序列分析。Seg-2序列分析表明，1995年至1997年，在雲南省分離出7種不同的血清型（BTV-1、-2、-3、-4、-12、-15、-16）BTV菌株，屬于A、B、G 6種基因型，BTV-12菌株的H、I和J、Seg-2屬于西部區域類型，其餘菌株的Seg-2屬于東部地區，Seg-3和Seg-10序列分析顯示，25個BTV菌株屬于東部區域類型Seg-7序列分析表明，1個BTV-2，2個BTV-12和1個BTV-16菌株屬于西部區域亞型，與南非和荷蘭的Seg-7菌株有最接近的親緣關系，其餘的菌株是東部區域。以上結果表明，雲南省存在多種血清型BTV流行，Seg-2和Seg-7基因重配菌株的發現表明，外來西部地區菌株已侵入雲南省，并在傳播過程中與中國菌株進行了基因重配。本研究為我國BTV的演化分析和溯源提供了資料參考。
藍舌病（BT）是由藍舌病毒（藍舌病毒，BTV）感染引起的嚴重出血性動物疾病。BTV主要通過蝸牛屬雌性昆蟲的吸血叮咬傳播，可感染牛、羊、駱駝、鹿等多種家養和野生反刍動物。綿羊的BTV感染可導緻更高的發病率和死亡率。感染BTV的牛和山羊往往沒有明顯的臨床症狀，在BTV傳播過程中起到了病毒儲存的作用。BT被世界動物衛生組織（OIE）列為動物疾病的必要通知，因為它每年給全球畜牧業生産造成約30億美元的經濟損失。
BTV屬于Reoviridae屬orbivirus，其基因組由10個（基因組片段1至10，Seg-1至10）雙鍊RNA（雙鍊RNA，dsRNA）片段組成，可編碼7個結構蛋白（VP1-7）和5個非結構蛋白（NS1-4和NS3a）。Seg-2 / VP2是BTV中突變最豐富的元件。VP2誘導受感染的動物産生特異性中和抗體，這對病毒血清型具有決定性作用。自2008年以來，全世界已經發現了四種新的BTV血清型（BTV-25-28）。結果，BTV血清型從24增加到28（BTV-1增加到28）。
雖然VP3序列在BTV菌株中高度保守，但編碼該蛋白的Seg-3序列随BTV菌株的流行區域而異，是以世界上BTV菌株根據其序列差異可分為東西方兩大地理類型（拓撲型）。與VP3類似，VP7和NS3蛋白也比較保守，編碼片段中Seg-7和Seg-10的序列變異也與BTV菌株流行區密切相關，根據Seg-7和Seg-10的序列差異，世界上的BTV菌株分為東西兩大區域類型， 以及幾個區域亞型。Seg-3、-7和-10序列具有很強的地理特征，是以上述基因組片段序列分析可以為追蹤病毒起源提供依據。
BT疫情于1979年首次記錄于雲南省石宗縣的綿羊中。此後，BT暴發于湖北、安徽、四川、山西等省，并已分離為BTV-1、-2、-3、-4、-12、-15、-16株，其中BTV-1和BTV-16在中國廣泛傳播，可導緻綿羊臨床症狀較為明顯。自2012年以來，在國家公益産業（農業）的專項資助下，雲南省畜牧獸醫科學研究院在雲南省、廣西壯族自治區、廣東省、湖北省、江蘇省、山西省、新疆維吾爾自治區和内蒙古自治區等8個省設立了哨兵動物，共生産12種血清型BTV菌株（BTV-1， -2、 -3、 -4、 -5、 -7、 -9、 -12、 -15、 -16、 -21 和 -24）。
多種血清型BTV在中國普遍存在，不同血清型菌株之間缺乏交叉保護，病毒通過突變和基因重配，并不斷産生突變菌株，這些都給目前的BT防控工作帶來了挑戰。對我國不同曆史時期的BTV流行菌株進行序列比較分析，有助于掌握BTV的演化特點和BTV流行菌株的溯源性分析。雖然該實驗室自2012年以來在中國完成了不同血清型BTV分離株的全基因組測序，但1995年至1997年雲南省BTV流行菌株的遺傳特征尚不清楚。為此，對1995年至1997年在雲南省從7個血清型中分離出來的25個BTV菌株的Seg-2、-3、-7和-10基因片段進行了擴增、測序和遺傳特征，以期為我國BTV的進化分析和溯源提供科學資料。
材料和方法
細胞、菌株和病毒培養
嬰兒倉鼠腎細胞（嬰兒倉鼠腎細胞，BHK-21），通過該實驗儲存;25株BTV毒株，從1995年至1997年在雲南省始宗、芒市、景洪、廬山等地建立的哨兵牛中分離出來，病毒分離資訊見表1。将分離出的BTV菌株接種BHK-21細胞，當細胞病變（細胞病變作用，CPE）達到90%刮掉細胞時，4°C 8000r/min離心15min，棄置沉澱，将病毒液分成，-80°C儲存備用。
底漆設計與合成
根據GenBank上發表的BTV菌株序列，使用Oligo 7.0軟體設計了10對引物，以擴增7種BTV血清型菌株中的Seg-2，-3，-7和-10（表2）。用焦碳酸二乙酯（DEPC）處理的水被稀釋至10mol / L的終濃度備用。
RT-PCR 擴增和測序
從病毒基因組DNA / RNA提取試劑盒中提取病毒核酸，然後在94°C下變性至3min并立即冰浴。以5 μL變性核酸為模闆，使用表2中的引物對，并使用一步法RT-PCR擴增BTV分離菌株的Seg-2，-3，-7和-10。采用通用DNA膠水回收純化試劑盒，電泳膠回收PCR産物，用PCR擴增的上遊和下遊引物作為測序引物，對純化的DNA進行雙向測序。
序列分析和系統樹建構
使用DNAstar軟體（Ver 6.0），使用MEGA 6.0軟體對測序結果進行序列拼接組裝和序列比較分析。建構具有最大相似（最大相同，ML）的系統發生樹：Seg-2序列選擇"GTR-G"模型，Seg-3序列選擇"TN93-G-I"模型，Seg-7序列選擇"GTR-G-I"模型，Seg-10序列選擇"T92加G"模型，自檢（自舉）值為1000。序列相似性，以平均值（平均值）表示。本研究中獲得的序列由黑色鑽石符号表示。系統樹中從其他國家分離出的BTV菌株的序列由"GenBank系列number_BTV血清型，分離的國家，病毒隔離時間"表示。
結果和分析
用于Seg-2、-3、-7和-10的RT-PCR擴增
設計10對引物（表2）對由Seg-2，-3，-7和-10分離的25個BTV菌株進行一步RT-PCR擴增。結果表明，7對不同血清型的引物Seg-2能夠特異性擴增大小約為1200bp的DNA片段，這與預期大小相對應，3對具有Seg-3，-7和-10的引物能夠特異性擴增1100，1100和800bp的DNA片段， 分别對應于預期的大小。
Seg-2 序列分析
序列比較分析表明，1995-1997年在雲南省分離的25個BTV菌株屬于7個血清型，如BTV-1、-2、-3、-4、-12、-15和-16。全球27種血清型（BTV-1至27種）BTV菌株的Seg-2可分為12種基因型（核型A-L）。在系統發生樹中，本研究中的25個BTV Seg-2菌株與相應的血清型BTV參考菌株聚類，屬于A，B，H，I，G和J等6種基因型，相應的血清型BTV國際标準參考菌株的Seg-2序列相似性大于68.10%，VP2序列相似性大于75.00%（圖1至2）， 通過血清中和和測試表明BTV血清型鑒定結果的正确性。在雲南省分離出的同一血清型BTV的Seg-2/VP2序列高度相似，Seg-2核苷酸序列的相似度在92.80%~100%之間，VP2氨基酸序列的相似度在96.90%~100%之間（圖2），表明雲南省流行的同一血清BTV的Seg-2有近期的共同祖先。
研究發現，同一血清型BTV的Seg-2菌株在序列上也存在較大差異，并且根據這種差異，相同血清型BTV的Seg-2可分為東部拓撲型和西部拓撲型。系統發生樹顯示，雲南省分離的兩株BTV-12株（B139和B334）與南非的BTV-12株成簇，序列相似度大于98.10%，屬于西部區域類型。雲南省BTV-1、-2、-3、-4、-15和-16分離的血清型菌株Seg-2與東部相同血清型菌株聚集，Seg-2序列相似度為89.0 3%~95.46%，VP2序列相似度在90.92%~98.30%之間，Seg-2序列與同一血清型西部區域菌株的相似性為68.00%~95.81% VP2序列的相似性介于75.28%和97.14%（圖1至圖2）。
賽格-3 序列分析
Seg-3序列比較分析表明，本研究中25株BTV菌株之間Seg-3核苷酸序列的相似度在79.35%~93.93%之間，VP3氨基酸序列的相似度在96.83%~99.95%之間（圖2）。建構的Seg-3系統樹顯示，從雲南省分離出來的25個BTV菌株，以及來自台灣、澳洲和印度的菌株，形成了東部區域類型（圖3）。25個BTV與國外分離的東部區域、西部和新血清型（BTV-25-28）的Seg-3序列相似度在74.63%~89.29%之間，VP3序列的相似度在88.69%~99.12%之間（圖2）。在東部區域類型中，來自雲南省的4個獨立的BTV-15菌株和一個澳洲BTV-15菌株形成相對獨立的叢集，形成遠東拓撲型（圖3），n個區域和西部區域之間的複活節Seg-3/ VP3序列相似性以及新血清型（BTV-25-28）菌株為75.18%至79.60%/介于88.20%至96.83%之間（圖2）。這一方面表明，雲南省和澳洲的BTV-15菌株Seg-3有着共同的起源，另一方面也表明基因段在進化上是獨立的。
賽格-7 序列分析
雲南省不同血清型BTV菌株Seg-7核苷酸序列的相似度在73.85%~94.36%之間，VP7氨基酸序列的相似度在85.96%~99.35%之間（圖2）。Maan等人已經證明，BTV的Seg-7可以分為三個東方地形1至3和七個西方地形1至7。從雲南省分離出來的21株BTV菌株中的Seg-7屬于東部拓撲型1至3個區域亞型，與來自台灣、日本、印度和澳洲的Seg-7菌株有最接近的親緣關系（圖4）。值得注意的是，雲南省有4個BTV Seg-7屬于西部區域類型：雲南省的BTV-2菌株（B238）和BTV-12菌株（B139和B334）屬于We Thestern拓撲型1區域亞型，與南非菌株有最接近的親緣關系，序列相似性大于98.60%，BTV-16（B034）菌株為西部拓撲型3區域亞型， 與荷蘭菌株（GQ506478）和南非菌株（GQ506512）的序列相似度為95.60%（圖4）。4個BTV菌株的Seg-7序列相似度在78.90%~100%之間，VP7序列相似度在94.60%~100%之間，複活節與雲南省分離 區域菌株的Seg-7/VP7序列相似性分别為78.33%~79.07%/94.46%~95.74%（圖2）。
賽格-10 序列分析
雲南省分離的25株BTV菌株的Seg-10核苷酸序列相似度為86.61%~94.68%，NS3氨基酸序列相似度在95.00%~99.08%之間（圖2）。BTV菌株Seg-10系統發生樹顯示，基因片段序列分為兩個東部地形型1至2和3個西方地形型1至3亞型（圖5）。從雲南省分離出來的22株BTV菌株均為東部1型區域亞型，與來自台灣、日本、印度和澳洲的Seg-10有最密切的親緣關系（圖5）。雲南省3個獨立的BTV-15株（B105、B358和B359）分别形成東部拓撲型2區域亞型，Seg與其他區域亞型菌株-10/NS3的序列相似性在76.93%~85.81%/83.41%~97.26%之間（圖2、5）。本研究東區拓撲1亞型、東方拓撲型2亞型和西部地區亞型25個BTV與其他菌株的Seg-10序列相似度在77.02%~91.37%之間，NS3序列的相似度在83.23%~97.55%之間（圖2，圖5）。
讨論
雲南省複雜的地理環境和氣候條件造就了該地區動物、植物和病毒的自然多樣性。雲南省地處中國邊境地區，與越南、寮國和緬甸等國家接壤，畜牧業和畜産品貿易頻繁，動物疫病跨境傳播風險高。多種血清型BTV在雲南省廣受歡迎，表明該地區在中國BT防控中發揮着重要作用。過去，BTV被認為主要流行于南緯35度和北緯40度之間。然而，随着氣候變暖、繭活動範圍的擴大和昆蟲媒介潛在傳播的增加，BT有逐漸向寒冷的高海拔、高緯度地區擴散的趨勢，對中國北方的牛羊養殖構成威脅。掌握1995-1997年雲南省BTV流行株的遺傳背景，可以為分析我國BTV的進化特征，開展病毒傳播和溯源分析提供有價值的序列資訊。
從1995年到1997年，該實驗室在雲南省分離出7種血清型BTV（BTV-1、-2、-3、-4、-12、-15和-16），自2012年以來一直在雲南省的哨點動物中分離出11種血清型BTV（BTV-1、-2、-3、-4、-5、-9、-12、-15、-16、-21和-24），表明雲南省流行的BTV血清型的多樣性。雲南省首次發現4種血清型BTV，BTV-5，-9，-21和-24，表明中國可能存在其他血清型BTV，是以對中國流行BTV多樣性的監測仍然是一個長期的過程。病毒位于不同的生态環境、不同的壓力選擇下，病毒的遺傳進化會呈現出特定的區域特征。研究發現，雲南省流行的BTV菌株序列也表現出獨特的區域特征：雲南省流行的BTV-15菌株的Seg-3形成了獨立于東西部區域菌株的進化分支，BTV-16菌株的Seg-2也形成了獨立的進化分支，BTV-15菌株的Seg-10形成了獨立的東方拓撲2區域亞型揭示了BTV在雲南省流行的進化獨特性。
入侵雲南省後，西部區域BTV菌株在傳播過程中與中國當地流行菌株進行了基因重配，BTV株的Seg-7片段可以在自然環境中相對自由地重新比對。這表明BTV進化可能主要由基因重配驅動，使病毒更适合在當地生态系統中傳播和生存。
通過分析1995-1997年雲南省從7個血清型中分離出來的Seg-2、-3、-7和-10、25個BTV菌株的遺傳特征，發現雲南省血清型BTV流行多種多樣，既有當地長期流行的BTV-1和BTV-16菌株，也有入侵雲南省後的西部區域BTV菌株， 再比對的應變，說明我國BT防控形勢十分嚴峻。本研究為分析中國BTV菌株的突變和基因再現提供了第一手資料，為追蹤中國BTV菌株的來源提供了依據。