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https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/tpj.16781
研究内容
德国莱比锡大学Severin Sasso教授领导的研究团队在The Plant Journal上发表的最新研究中，对莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）组蛋白基因内的顺式激活调控元件（CREs）进行了深入的鉴定与表征。该研究不仅揭示了基因表达调控的新机制，加深了我们对真核生物中增强子和CREs功能的认识，而且为莱茵衣藻在生物技术领域的应用，如生物能源生产、环境修复和作物改良等，提供了关键的遗传工具和分子生物学基础。
研究背景
顺式调控模块CRM，Cis-Regulatory Module）是基因组中的特定DNA序列，它们负责调控基因的表达模式。CRMs由启动子、增强子、沉默子和绝缘子等多种顺式调控元件(CRE, Cis-Regulatory Element）组成。通过与转录因子等反式作用因子结合，CRMs能够增强或抑制基因的转录，从而调控基因表达的强度、时间和空间分布。CRMs在生物体的发育、细胞类型特异性表达、以及对环境变化的响应中起着至关重要的作用，是生物体内基因表达调控网络的关键组成部分。
主要结果
1. 鉴定组蛋白中保守的CREs
在莱茵衣藻的组蛋白基因中，研究人员鉴定了四个保守的顺式激活元件（CREs），其中EH3/H4、EH2A/H2B这两个元件在莱茵衣藻组蛋白基因间区域保守存在，Eupstr在高表达核基因的转录起始位点（TSS）上游约65 bp处高度富集，Ehist cons元件则是一个在被子植物和莱茵衣藻组蛋白基因区域普遍存在，高度保守的8个碱基（称为Oct基序）序列（图1）。
图1 EH3/H4、EH2A/H2B、Eupstr和Ehist cons元件的相对位置和它们在基因组中的保守性。
2. 报告载体的构建与活性测试
研究人员构建了包含4X CRE、启动子和mCerulean3荧光蛋白基因的报告载体，并将其整合到莱茵衣藻的核基因组中，通过流式细胞仪量化了CRE激活活性（图2）。在对四个候选激活CRE的活性评估中发现，EH3/H4、EH2A/H2B这两个元件并没有显示出对报告基因表达的上调作用。Eupstr能够显著增强mCerulean3荧光蛋白的表达，并且其增强效果与强启动子PHSP70A-RBCS2相当（图3）。
图2：实验流程图：通过电穿孔将含有CRE、启动子和mCerulean3荧光报告基因的载体转入莱茵衣藻的核基因组，然后通过流式细胞仪量化报告基因的表达。
图3：四个候选激活CREs（EH3/H4、EH2A/H2B、Eupstr和Ehist cons）的活性评估。通过流式细胞仪测量的mCerulean3荧光强度，可以用来比较这些CREs是否能够增强PRBCS2启动子的活性。
3. 探究影响Eupstr激活效果的因素
在本文中，研究人员对Eupstr这一顺式激活调控元件（CRE）的功能特性进行了进一步研究。1.探究了Eupstr的活性与数量的关系，当使用8X Eupstr与RBCS2启动子结合时，mCerulean3荧光蛋白的表达水平下降至与单独RBCS2启动子相当的水平，增加CRE的数量至8个拷贝并不会增强其激活效果（图4b）。2. Eupstr与强启动子PHSP70A-RBCS2的结合是并不会增强其激活活性（图4c）。3. Eupstr的激活效果是位置依赖性的，但与方向无关。当Eupstr位于RBCS2启动子的上游时，能够显著提高基因表达，而当Eupstr位于下游时，这种激活效应则消失,且Eupstr的方向变化并不影响其激活活性（图5）。4.在测试Eupstr与启动子的距离依赖性时，通过在Eupstr和启动子之间插入一个1.5-kb的间隔，发现Eupstr未能在这个距离上激活RBCS2启动子，这表明Eupstr的激活作用具有一定的距离限制（图7b），而Ehist cons即使在1.5-kb的距离上也能提高基因表达（图7c）。这些发现为理解Eupstr在基因表达调控中的作用提供了重要的见解，并为未来在莱茵衣藻及其他可能的生物体系中应用Eupstr作为遗传工具提供了实验依据。
图4 评估了8X Eupstr和与PHSP70A-RBCS2组合的效果。
图5 评估了Eupstr的位置和方向依赖性。
图7 评估了Eupstr和Ehist cons的距离依赖性。
4. 顺式激活调控元件在生物技术应用中的潜力
激活CREs在生物技术领域，特别是在基因工程中的应用，已经在被子植物中得到了较为广泛的探索和利用，而在莱茵衣藻中的应用相对较少，可能是由于缺乏关于CREs激活的基因表达长期稳定性的数据。为了测试激活CREs是否能够支持长期的基因表达，研究人员将含有Eupstr与RBCS2启动子结合的报告载体转化到莱茵衣藻中。通过对转化后的细胞进行流式细胞术分析，发现高表达mCerulean3的细胞比例在经过筛选和传代后有所下降，表明过表达的核基因在莱茵衣藻中的表达是中等稳定的。
图8 Eupstr激活的mCerulean3表达的稳定性。
研究人员在一个经过专利认证的菌株UVM11-CW中进一步验证了Eupstr的激活功能，即便在缺乏顺式激活元件（CRE）的条件下，PRBCS2启动子在UVM11-CW中也能够有效地驱动基因的高水平表达。当Eupstr存在时会进一步提升报告基因的表达，这一结果进一步证实了激活型CREs在增强基因表达方面的有效性。总体而言，Eupstr和Ehist cons这两个激活型CREs已被证实能够在莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）的核基因组中激活基因表达。这些特定的CRE-启动子组合不仅为实现目标基因的过表达提供了新的策略，而且为其他生物技术应用，如合成生物学和基因工程，开辟了新的可能性。
图9 Eupstr在莱茵衣藻UVM11-CW菌株中的基因上调作用。
结论
本文深入研究了莱茵衣藻中组蛋白基因的顺式激活调控元件（CREs），通过构建报告基因系统并利用流式细胞术，研究发现了两个具有显著上调基因表达功能的CREs，即Eupstr和Ehist cons。Eupstr是一个不依赖于方向的CRE，能够激活RBCS2和β2-tubulin启动子，而Ehist cons则显示出与特定启动子的结合特异性。此外，研究还探讨了这些CREs的位置、方向和距离依赖性，以及它们在生物技术中的应用潜力。这些发现不仅扩展了我们对莱茵衣藻基因表达调控机制的认识，而且为利用这些顺式调控元件进行基因工程和合成生物学研究提供了新的工具。
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